同型半胱氨酸試劑檢測的性能驗證

帥奉飛，毛萬成，田敏

（思南縣人民醫院，貴州 思南 565100）

臨床研究

同型半胱氨酸試劑檢測的性能驗證

帥奉飛，毛萬成，田敏

（思南縣人民醫院，貴州 思南 565100）

目的分析探討北京九強（循環酶法）同型半胱氨酸在貝克曼AU680全自動生化分析儀上檢測的性能驗證。方法依據CLSI-EP相關文件，在AU680生化分析儀上對該試劑盒的準確度、重復性、線性、靈敏度、特異性、精密度、臨床可報告范圍、回收實驗等方面進行性能評價。結果準確度偏差＜5.48%、重復性CV＜2.09%、線性R2=0.999,6、靈敏度=0.379,6、批內精密度（CV）為1.34%、批間精密度（CV）為1.31%；線性范圍1.5 μmol/L-50 μmol/L，最大稀釋倍數為8，臨床可報告范圍1.5 μmol/L-400 μmol/L；抗壞血酸＜20 mg/dL、血紅蛋白＜1,200 mg/dL、膽紅素＜20 mg/dL、甘油三酯＜2,500 mg/dL，對試驗無明顯干擾、回收率101.7%。結論北京九強（循環酶法）同型半胱氨酸在貝克曼AU680全自動生化儀上的分析性能良好，可用于臨床檢測。

同型半胱氨酸；試劑；性能驗證；檢測

同型半胱氨酸（Hcy）是一種含基的氨基酸，主要來源于飲食攝取額度蛋氨酸，是蛋氨酸和半胱氨酸代謝過程中一個重要的中間產物，其本身并不參加蛋白質的合成。Hcy最直接的危害是損傷血管，對血管內皮產生毒素，參與動脈粥樣的產生和斑塊形成等，是心腦血管疾病的一個獨立危險因素，高Hcy水平可以反映相關疾病的危險程度[1]近年來，隨著循環酶法檢測同型半胱氨酸試劑盒大量上市，我們申報的“Hcy與炎性反應的相關性”作為國家“863”計劃項目的一個子課題，為了使我們實驗室檢測的Hcy結果更加準確可靠，本研究特對我們使用的北京九強循環酶法同型半胱氨酸在AU680全自動生化儀上檢測性能進行了詳細分析。

1 材料與方法

1.1 評價系統

1.1.1 儀器 貝克曼AU680全自動生化分析儀。

1.1.2 試劑 同型半胱氨酸檢測試劑盒HCY批號：16-0816（北京九強生物技術股份有限公司）；校正血清：GCHCY，批號：16-0816；質控血清：GQ-HCY/2，批號：16-0418；實驗基質：檢驗科混合血清，干擾試驗材料：實驗材料：VC 500 mg/dL；血紅蛋白10,000 mg/dL；膽紅素500 mg/dL；甘油三酯20,000 mg/dL。

1.1.3 檢測原理 Hcy在Hcy甲基轉移酶及S-腺苷Hcy水解酶的共同作用下循環放大，同時產生腺苷。腺苷被水解成氨和次黃苷，氨在谷氨酸脫氫酶催化下使NADH轉化成NAD+，在340 nm處檢測反應吸光度，其變化率與Hcy的濃度成正比。

1.1.4 檢測參數 采用兩點速率法，主波長340 nm，樣本13 UI，R1試劑240 UI，R2試劑65 UI。

1.2 樣本 本院門診、住院患者及健康體檢者的血清樣本。

1.3 方法及指標判定 每天先測定2個水平質控品，按實驗室室內質控規則（1.3 s、2.2 s）進行質控，在控后再進行試劑性能評價。性能評價指標：依據CLSI-EP相關文件，在AU680生化儀上對北京九強循環酶法Hcy測定試劑盒進行準確度、重復性、線性、靈敏度、特異性、精密度、臨床可報告范圍、回收實驗等方面進行性能評價，并與試劑廠家聲明的參數進行比較。

1.3.1 準確性 質控血清：GQ-HCY/2，批號：16-0418，測三次，計算其偏差，準確性偏差應不超過±10%。

1.3.2 重復性 測定檢驗科混合血清，重復測定20次，重復性的變異系數CV應≤10%；

1.3.3 線性 留取高值樣本，按照濃度梯度1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32倍比稀釋，重復三次，取平均值，最后做出線性曲線，要求R2≥0.99。

1.3.4 靈敏度 連續檢測去離子水10次，計算測值的平均值，SD，以平均值+3＊SD對應的濃度為試劑的分析靈敏度。

1.3.5 干擾試驗（特異性） 以檢驗科的混合血清為基質，添加干擾物后檢測，在病人混合血清180 μL中分別加入甘油三酯、膽紅素、血紅蛋白、VC干擾物，干擾物濃度梯度為1、1/2、1/4、0，再分別測定樣本值，分析添加干擾物后測量的偏差；判斷標準：與平均值作比較，干擾物測值偏差不超過±10%視為無干擾。

1.3.6 精密度 連續5天測定檢驗科混合血清，每天測定4次，批內精密度，批間精密度，變異系數CV應≤10%。

1.3.7 臨床可報告范圍驗證 選擇高值樣本，分別做不同倍數的稀釋，稀釋后測量值與理論值間的偏差應在±10%以內，用線性乘以最大稀釋倍數得出的數值即為可報告范圍上線。

1.3.8 回收率驗證 用5%的高濃度樣本加入到95%的低濃度基質血清中混勻檢測，并計算其理論值，測量值與理論值間偏差不超過10%。

2 結果

2.1 干擾試驗分析結果 見表1。

2.2 Hcy試劑在貝克曼AU680全自動生化分析儀上檢測的性能驗證結果 驗證指標判定標準驗證結果：準確性：GQ-HCY/2，批號：16-0418，靶值12.22，偏差=5.48%；重復性：檢驗科混合血清，重復測定20次，計算CV，CV=2.09%；線性留取高值樣本，按照濃度梯度1、1/2、1/4， 1/8、1/16、1/32倍比稀釋，重復三次，取平均值，做出線性曲線，求出R2，R2=0.999,6；靈敏度：水為樣品檢測10次后，計算均值+3SD的濃度，靈敏度=0.379,6；特異性抗壞血酸≤20 mg/dL，膽紅素≤20 mg/dL，紅蛋白≤1,200 mg/dL，甘油三酯≤2,500 mg/dL，對HCY均無影響，偏差不超過±10%，血各項偏差都在±10%以內；精密度：連續5天測定檢驗科混合血清，每天測定4次，批內、批間精密度的變異系數CV應≤10%，批間精密度CV=1.31%；臨床可報用高值樣本，分別做不同倍數的稀釋，稀釋后臨床可報告測量值與理論值間的偏差在±10%以內的最大稀釋倍數乘以線性得出可報告圍上線，稀釋后臨床可報告范圍為：1.5 μmol-400 μmol；回收率：以5%的高濃度樣本加入到95%的低濃度基質血清中混勻檢測，并計算其理論值，測量值與理論值間偏差不超過10%，回收率為：101.73%。

表1 同型半胱氨酸循環酶法干擾試驗因素分析

2.3 結論 根據CLSI-EP相關文件及國家衛生行業有關判定標準[2]，同型半胱氨酸檢測試劑盒（北京九強）各項性能指標符合標準要求，性能驗證通過。

3 討論

Hcy為含巰基氨基酸，是胱硫醚和蛋氨酸轉硫化和甲基化代謝旁路中形成的中間體。80%的Hcy在血中通過二硫鍵與蛋白質結合，只有很少一小部分游離Hcy參加循環。自20世紀60年代初在尿中首次被發現以來，Hcy被認為與多種先天性代謝缺陷有關，如胱硫醚β合成酶缺乏是已知的造成高同型半胱氨酸尿癥的原因。

最近，人們又發現高同型半胱氨酸血癥是發生外周血管、腦血管和冠狀動脈血管疾病的危險因素之一。隨著研究的深入，血漿Hcy作為心腦血管病尤其是腦卒中的獨立危險因子的地位已經得到確立。鑒于我國腦卒中發病率（250/10萬）明顯高于國外，故有學者提出了“H”型高血壓的概念，強調在控制血壓的同時，還要控制高同型半胱氨酸血癥。國外的HOPE-2再研究已確認葉酸預防腦卒中有效，其中65%的患者合并了ACEI類藥物使腦卒中風險顯著下降25%。國內亦有學者使用依那普利加葉酸片控制伴有Hcy升高的高血壓病患者，并取得良好效果。

由實驗結果可知，Hcy批內精密度（CV）為1.34%，批間精密度（CV）為1.31%遠低于國際公認質量標準（允許精密度小于6%）[3]，用高值樣本進行倍比稀釋上機檢測求R2=0.999,6，高于衛生行業標準的0.995要求，故完全能滿足性線要求。在做回收實驗時發現，最開始定標是用的北京九強Hcy試劑盒自帶的兩點定標校準品進行校準后，做回收實驗，計算出回收率都在200%左右，向廠家提出要求解決，最后通過分析可能是由于定標原因，及時更換了六點定標液，由以前的兩點定換成了六點定標，再做回收試驗，其結果為101.73%，回收試驗在可控范圍內，參照文獻分析其原因[4]，兩點定標檢測結果比多點定標檢測結果比較，用兩點定標曲線檢測的結果偏差較大，不能滿足檢測要求。兩點定標和多點定標的區別在于，兩點定標曲線是一條直線，而多點定標則是一條曲線，做回收試驗低值標本和高值標本混合后檢測，導致兩種定標方法所做結果差異較大。故將該試劑盒換成六點定標后的批內精密度、批間精密度、線性和回收率均達到要求[5]。

循環酶法是目前臨床測定血清Hcy最新的一種化學方法，與以前免疫、電泳、色譜等方法相比，更具有操作簡單，靈敏度高，線性范圍寬，抗干擾因素強，精密度較好，可自動化等優點，隨著對同型半胱氨酸的臨床研究的深入，其定量測定意義越來越受到重視，因此本實驗采用一系列較為簡化且合理的方法對其進行方法學評價[6,7]，為保證檢測結果的正確可靠有著十分重要的臨床意義。

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國家高技術研究發展計劃（863計劃）（No.2014AA022304）