慢性自發性蕁麻疹患者外周血Treg細胞比例和白細胞介素17A、27水平及意義

王亞婷 石春蕊 武奕 師蓓 熊瀟 周蘭霞

730000蘭州大學第一臨床醫學院蘭州大學第一醫院皮膚性病科

慢性自發性蕁麻疹患者外周血Treg細胞比例和白細胞介素17A、27水平及意義

王亞婷 石春蕊 武奕 師蓓 熊瀟 周蘭霞

730000蘭州大學第一臨床醫學院蘭州大學第一醫院皮膚性病科

目的探討外周血中CD4+CD25+CD127low調節性T（Treg）細胞、白細胞介素17A（IL?17A）和IL?27在慢性自發性蕁麻疹發病機制中的作用。方法收集37例慢性自發性蕁麻疹患者和40例健康對照外周血標本。采用流式細胞儀檢測外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg細胞比例，酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清中IL?17A和IL?27水平。結果慢性自發性蕁麻疹患者外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg細胞比例（5.99%±2.72%）明顯低于健康對照組（9.07%±3.44%，t=4.325，P＜ 0.01），IL?27水平［（20.54 ± 7.65）ng/L］亦低于健康對照組［（26.63± 9.72）ng/L，t=3.039，P=0.003］，IL?17A表達水平與健康對照組差異無統計學意義（P=0.529）。慢性自發性蕁麻疹患者IL?17A表達水平與CD4+CD25+CD127lowTreg細胞比例呈負相關（r=-0.359，P=0.029），IL?17A、IL?27、CD4+CD25+CD127lowTreg細胞比例與UAS評分均無顯著相關性（r值分別為-0.076、-0.083、-0.053，均P＞0.05）。結論慢性自發性蕁麻疹患者外周血中可能存在Th17/Treg細胞失衡，且IL?27可能參與慢性自發性蕁麻疹的發病過程。

蕁麻疹；白細胞介素17；T淋巴細胞，調節性；白細胞介素27

研究表明，慢性自發性蕁麻疹（chronic spontaneous urticaria，CSU）患者體內存在CD4+CD25+調節性T細胞和Th17細胞間的失衡，可能是其發病的機制之一［1］。白細胞介素17A（IL?17A）是主要由Th17細胞分泌的一類促炎因子，參與自身免疫、炎癥反應，起免疫監視作用。IL?27是對Th17/Treg細胞有調節作用的細胞因子，促進Treg細胞分化，阻止Th17細胞分化［2］。Th17/Treg細胞軸及其相關細胞因子在CSU中的調節機制尚不完全清楚，且IL?27在CSU病理過程中對Th17/Treg細胞軸的影響也不清楚。我們檢測CSU患者外周血CD4+CD25+CD127lowTreg細胞比例，測定IL?17A及IL?27表達，分析CD4+CD25+CD127lowTreg細胞、IL?17A 和IL?27之間的相關性，探討其在CSU發病中的作用。

一、對象與方法

1.研究對象：CSU患者37例，來自2016年1-6月蘭州大學第一醫院皮膚科門診，均符合CSU診斷標準［3］。其中男19例，女18例，年齡（40.41±15.33）歲，平均病程16.4個月（3個月至10年）。對照組40例，其中男21例，女19例，年齡（41.85±14.44）歲，均為本院健康體檢者。兩組受試者性別（P=0.551）及年齡（P=0.672）分布差異均無統計學意義。

2.試劑和儀器：人IL?17A ELISA試劑盒（編號GR213356?6）來自英國abcam公司，人IL?27 ELISA試劑盒來自武漢華美生物工程有限公司（編號：W23010221）。鼠抗人CD4異硫氰酸熒光素熒光抗體、CD25別藻藍蛋白熒光抗體、CD127藻紅蛋白熒光抗體均來自美國BD公司。全自動酶標儀（型號Victor2）產自芬蘭珀金埃爾默公司。流式細胞儀（型號FACSCANTOⅡ）產自美國BD公司。

3.標本的收集與檢測：抽取受試者外周血8 ml，分為抗凝血4 ml和促凝血4 ml。將抗凝血在4 h內進行流式細胞儀分析；用促凝血分離血清，-80℃冰箱保存待測，采用ELISA雙抗體夾心法測定血清IL?17A、IL?27濃度。

（1）流式細胞儀檢測Treg細胞：按照試劑盒說明書進行。將100 μl抗凝血樣品加入到流式管，分別加入CD4抗體、CD25抗體、CD127抗體，室溫避光孵育20 min；將450 μl紅細胞裂解液加入流式管中，室溫避光孵育10 min；離心5 min，棄上清液；PBS清洗后重懸細胞，2 h內使用流式細胞儀檢測，用軟件BD FACSDiva 7.0對檢測數據加以分析。

（2）ELISA檢測血清IL?27、IL?17A濃度：分別按照試劑盒說明書進行。最后于酶標儀上450 nm波長處檢測每孔的吸光度，并計算IL?27和IL?17A濃度。

4.疾病評分判定標準：根據EAACI/GA2LEN/EDF/WAO制定的蕁麻疹活動性評分（UAS）［3］評估。瘙癢：0分為無癥狀，1分為輕微癥狀，2分為中度癥狀對生活存在一定影響，3分為嚴重癥狀不能忍受。風團數目：0分為無風團，1分為新發風團1～19個/24 h，2分為20～50個/24 h，3分為＞50個/24 h。風團與瘙癢評分之和為UAS總分。

5.統計學分析：采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析。計量資料在方差齊性檢驗后進行t檢驗，相關性分析使用Spearman相關檢驗，顯著性檢驗水平為0.05。

二、結果

CSU患者組CD4+CD25+CD127lowTreg細胞比例（圖1）和血清IL?27水平均低于對照組（P＜ 0.01）；血清IL?17A水平兩組間差異無統計學意義（P=0.529），見表1。CSU患者CD4+CD25+CD127lowTreg細胞比例與血清IL?17A水平呈負相關（r=-0.359，P=0.029），與IL?27無顯著相關性（r=-0.141，P=0.404），IL?17A與IL?27亦無顯著相關性（r=0.053，P=0.754）；CSU患者UAS評分與IL?17A水平、IL?27水平、CD4+CD25+CD127lowTreg細胞比例均無顯著相關性（r值分別為-0.076、-0.083、-0.053，均P＞ 0.05）。

三、討論

Treg細胞是一類具有免疫抑制性的T細胞亞群，在維持機體免疫耐受和免疫穩態中具有重要作用［4］。轉錄因子叉頭狀/翼狀螺旋轉錄因子 3（forkhead or winged helix transcription factor 3，Foxp3）是人細胞的特異性標志，是Treg細胞分化、發育的關鍵調節因子［5］，既往研究常使用CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例反映Treg細胞水平，但使用Foxp3標記時，處理標本需要固定、打孔等步驟，導致細胞損傷，使Treg細胞檢出率與實際水平相差較大。最近研究發現，使用CD4+CD25+CD127low標記Treg細胞時可以避免Foxp3標記過程中導致的細胞損傷，保證Treg細胞更好的活性和完整性，更準確地反映實際水平，故本研究使用CD4+CD25+CD127low細胞比例反映Treg細胞水平是目前較為理想的檢測指標［6］。我們發現CSU患者外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg細胞百分比及IL?27水平均明顯低于健康對照組，與既往結果一致［2，7］。Arshi等［7］認為慢性蕁麻疹的免疫失調由Treg細胞比例下降引起，慢性蕁麻疹中Th17/Treg比例失衡，并且其相關細胞因子及趨化因子在CSU發病中具有重要作用，但Th17/Treg細胞如何發揮作用目前并未闡明。本研究顯示，IL?17A水平在CSU患者及健康對照組之間并無明顯差異，這與Arshi等［7］研究一致，但與國內部分學者的研究結果并不一致［2，8］，我們推測可能與實驗人群所在區域的地理及人文環境不同有關。李潤祥等［8］認為，IL?17A經血液循環到達皮膚和黏膜，釋放更多炎癥因子，促進機體全身和局部免疫應答及炎癥反應是造成CSU發病的重要機制。IL?27可以通過STAT1途徑抑制IL?17A產生，抑制Th17細胞生成［9］，同時對Treg細胞具有雙向調節作用［10］，但在CSU發病中的作用尚不知曉。我們研究發現IL?27在CSU發病中，可能對Treg細胞具有正性調節作用，但對Th17細胞的作用與IL?27的生理作用不一致，這可能是由于IL?27僅是影響Th17細胞分化途徑中的一個方面，還有更多的未知因素影響CSU發病機制中Th17細胞分化途徑。作為調節Th17細胞及Treg細胞的關鍵細胞因子，IL?27降低可能是CSU患者Th17/Treg細胞失衡的重要原因。

CSU患者外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg細胞比例及IL?27水平均明顯低于健康對照組，但兩者之間無明顯相關性，CD4+CD25+CD127lowTreg細胞比例與IL?17A水平之間呈負相關。由此我們推測Treg細胞比例降低，可能導致炎癥反應加重，同時IL?17A促炎作用進一步加重炎癥反應；CSU患者體內IL?27水平降低可能會導致CSU患者T細胞亞群比例失調，且可能使Treg分泌IL?10減少，負性調節作用減弱。因此筆者認為在CSU患者體內存在Th17細胞與Treg細胞之間的失衡。本研究未發現IL?27與CD4+CD25+CD127lowTreg細胞之間存在相關性，二者之間的聯系及作用機制尚需進一步研究；Treg細胞比例、IL?17A和IL?27水平與UAS評分無明顯相關性，推測三者可能只參與CSU發病及調節過程，不能反映其嚴重程度。今后應對CSU患者體內Th17/Treg細胞軸及其相關因子的功能和調節途徑進行深入研究。

圖1 流式細胞儀檢測外周血CD4+CD25+CD127lowTreg細胞比例

表1 慢性自發性蕁麻疹患者CD4+CD25+CD127lowTreg細胞比例、IL?17A和IL?27水平（±s）

表1 慢性自發性蕁麻疹患者CD4+CD25+CD127lowTreg細胞比例、IL?17A和IL?27水平（±s）

注：IL，白細胞介素

CD4+CD25+CD127low Treg（%）5.99±2.72 9.07±3.44 4.325 0.000組別患者組對照組t值P值例數37 40 IL?27（ng/L）20.54±7.65 26.63±9.72 3.039 0.003 IL?17A（ng/L）53.81±8.55 52.82±4.35 0.633 0.529

［1］沈斌,冷建杭,王克義,等.慢性特發性蕁麻疹患者外周血調節性T細胞和IL?17水平的研究［J］.中華皮膚科雜志,2010,43（12）:871?872.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2010.12.017.

［2］Yoshida H,Nakaya M,Miyazaki Y.Interleukin 27:a double?edged sword for offense and defense［J］.J Leukoc Biol,2009,86（6）:1295?1303.DOI:10.1189/jlb.0609445.

［3］Zuberbier T,Aberer W,Asero R,et al.The EAACI/GA（2）LEN/EDF/WAO Guideline for the definition,classification,diagnosis,and management of urticaria:the 2013 revision and update［J］.Allergy,2014,69（7）:868?887.DOI:10.1111/all.12313.

［4］Sakaguchi S,Sakaguchi N,Asano M,et al.Immunologic self?tolerance maintained by activated T cells expressing IL?2 receptor alpha?chains（CD25）.Breakdown of a single mechanism of self?tolerance causes various autoimmune diseases［J］.J Immunol,1995,155（3）:1151?1164.

［5］Li KK,Ward ST,Curbishley SM,et al.A novel subset of functional interleukin?10 secreting CD8 regulatory T cells infiltrate human hepatocellular carcinoma［J］.Lancet,2013,381（9）:S64.DOI:10.1016/S0140?6736（13）60504?8.

［6］王會平,翟志敏,張愛梅,等.CD4+CD25+CD127low識別人外周血CD4+CD25+調節性T細胞的優勢［J］.中國免疫學雜志,2008,24（12）:1059?1062.

［7］Arshi S,Babaie D,Nabavi M,et al.Circulating level of CD4+CD25+FOXP3+T cells in patients with chronic urticaria［J］.Int J Dermatol,2014,53（12）:e561?566.DOI:10.1111/ijd.12630.

［8］李潤祥,梁碧華,楊婧,等.慢性自發性蕁麻疹患者血清IL?17、IL?23水平的檢測及意義［J］.皮膚性病診療學雜志,2013,20（1）:19?21.DOI:10.3969/j.issn.1674?8468.2013.01.006.

［9］Diveu C,McGeachy MJ,Boniface K,et al.IL?27 blocks RORc expression to inhibit lineage commitment of Th17 cells［J］.J Immunol,2009,182（9）:5748 ?5756.DOI:10.4049/jimmunol.0801162.

［10］Huber M,Steinwald V,Guralnik A,et al.IL?27 inhibits the development of regulatory T cells via STAT3［J］.Int Immunol,2008,20（2）:223?234.DOI:10.1093/intimm/dxm139.

Proportion of regulatory T cells and expression of interleukin?17A and ?27 in the peripheral blood of patients with chronic spontaneous urticaria and their significance

Wang Yating,Shi Chunrui,Wu Yi,Shi Bei,Xiong Xiao,Zhou Lanxia
Department of Dermatology and Venereology,The First Hospital of Lanzhou University,The First Clinical Medical College of Lanzhou University,Lanzhou 730000,China

Shi Chunrui,Email:stone7207@126.com

ObjectiveTo explore the role of peripheral blood CD4+CD25+CD127lowTreg cells,interleukin?17A（IL?17A）and IL?27 in the pathogenesis of chronic spontaneous urticaria（CSU）.MethodsPeripheral blood samples were obtained from 37 patients with CSU（CSU group）and 40 healthy controls（control group）.Flow cytometry was performed to determine the percentage of CD4+CD25+CD127lowTreg cells in the peripheral blood,and enzyme?linked immunosorbent assay（ELISA）to detect the serum levels of IL?17A and IL?27.ResultsThe percentage of CD4+CD25+CD127lowTreg cells in the peripheral blood（5.99%±2.72%vs.9.07%±3.44%,t=4.325,P＜0.01）and the serum level of IL?27（20.54±7.65 ng/Lvs.26.63±9.72 ng/L,t=3.039,P=0.003）were both significantly lower in the CSU group than in the control group.However,there was no significant difference in the serum level of IL?17A between the 2 groups（P=0.529）.Among the patients with CSU,the level of IL?17A was negatively correlated with the percentage of CD4+CD25+CD127lowTreg cells（r=-0.359,P=0.029）,while the urticaria activity score（UAS）was uncorrelated with the levels of IL?17A and IL?27 as well as the percentage of CD4+CD25+CD127lowTreg cells（r=-0.076,-0.083,-0.053 respectively,allP＞ 0.05）.ConclusionThere may be Th17/Treg imbalance in the peripheral blood of patients with CSU,and IL?27 may be involved in the occurrence of CSU.

Urticaria;Interleukin?17;T?lymphocytes,regulatory;Interleukin?27

Fund program:Health Industry Research Project of Gansu Province（GWGL2014?60）

石春蕊，Email：stone7207@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.12.014

甘肅省衛生行業科研計劃管理項目（GWGL2014?60）

2016?12?11）

尚淑賢）