眼皮膚白化病一家系基因突變分析

胡蘇瑋 何曉燕 李潔 朱湘玉 徐貴江 張坡

225002江蘇，揚州大學醫學院附屬醫院 揚州市婦幼保健院醫學遺傳中心（胡蘇瑋、何曉燕、徐貴江、張坡）；南京大學醫學院附屬鼓樓醫院婦產科（李潔、朱湘玉）

·研究報道·

眼皮膚白化病一家系基因突變分析

胡蘇瑋 何曉燕 李潔 朱湘玉 徐貴江 張坡

225002江蘇，揚州大學醫學院附屬醫院 揚州市婦幼保健院醫學遺傳中心（胡蘇瑋、何曉燕、徐貴江、張坡）；南京大學醫學院附屬鼓樓醫院婦產科（李潔、朱湘玉）

目的利用靶向二代測序技術對1個眼皮膚白化病家系進行基因突變分析。方法收集1個眼皮膚白化病家系的臨床資料，提取先證者及其父母外周血DNA。通過高通量測序技術，對先證者TYR、OCA2、TYRP1、SLC45A2等29個基因的外顯子編碼區進行直接測序，尋找可能存在的基因突變。以Sanger測序技術檢測先證者父母的相應基因位點。結果先證者TYR基因檢測到2個雜合突變，分別是c.534G ＞C（p.Trp178Cys）和c.1147G ＞A（p.Asp383Asn）。其中c.534G ＞C突變為新發突變，c.1147G＞A突變為已知致病突變。先證者父母TYR基因突變檢測結果證實，先證者的c.534G＞C突變來自父親，c.1147G＞A突變來自母親。結論應用靶向二代測序技術為一個眼皮膚白化病家系確定了TYR基因致病性新突變c.534G＞C。

白化病，眼皮膚；基因分型技術；突變；產前診斷

白化?。╝lbinism）是一組由黑素生物合成缺陷引起的常染色體隱性遺傳病。臨床上白化病分為非綜合征型和綜合征型。非綜合征型白化病又分為眼白化?。╫cular albinism，OA）和眼皮膚白化?。╫culocutaneous albinism，OCA）。眼皮膚白化病以皮膚、毛發和眼睛的部分或完全性黑素缺乏和視力低下、畏光等為主要表現。OCA具有高度遺傳異質性，根據致病基因不同，目前共分為7種亞型［1］，常見的OCA1～4型分別由酪氨酸酶基因（tyrosinase，TYR）、P蛋白基因、酪氨酸酶相關蛋白1（tyrosinase?related protein 1，TYRP1）以及膜相關轉運蛋白（membrane?associated transport protein，MRTP）基因突變導致。OCA5～7型臨床上較為罕見。眼皮膚白化病各型在臨床表型方面具有一定的重疊和交叉，僅依據臨床表現難以準確分型，分子診斷是分型的唯一依據。我們利用靶向二代測序（targeted next?generation sequencing，TGS）方法對一個OCA家系進行基因突變分析。

一、臨床資料

先證者男，18個月齡，頭發、皮膚黑素完全缺失，眉毛黑素部分缺失；虹膜色淡，畏光，眼球水平震顫，臨床表現符合白化病的表型特征。先證者父母表型均正常，非近親結婚，孕期無用藥史和不良環境接觸史。先證者母親家族中曾有1例白化病患者，已病故，死因不詳。先證者母親現再次妊娠，孕16周時至我院遺傳中心咨詢，要求進行白化病基因檢測及產前診斷。患者家系圖見圖1。本研究通過揚州市婦幼保健院醫學倫理委員會批準，患者親屬簽署知情同意書。

二、方法

1.高通量基因測序：采集先證者及其父母外周靜脈血2 ml，采用QIAamp DNA提取試劑盒（德國Qiagen公司）提取基因組DNA，并測量其吸光度值。提取的DNA用DNA酶片段化后進行純化，隨后PCR擴增并連接上接頭序列，使用TruSight One Sequencing Panel（美國Illumina Inc公司）試劑盒經2次捕獲及純化，PCR擴增和純化，獲得最終文庫，在MiSeq測序儀（美國Illumina Inc公司）上對TYR、OCA2、TYRP1、SLC45A2等29個基因外顯子區進行高通量測序，該測序由廣州金域醫學檢驗中心提供技術支持。

2.數據分析：所有數據用BWA算法比對到參考序列（UCSC hg19），ANNOVAR工具對數據進行注釋。使用千人基因組計劃數據庫（http：//www.internationalgenome.org/）、ESP6500數據庫（http：//evs.gs.washington.edu/EVS/）、HGMD（Human Gene Mutation Database）數據庫（http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）篩選、注釋；SIFT（Soring intolerant from tolerant）、Polyphen?2（Polymorphism phenotype）軟件進行錯義變異的生物信息學分析。綜合各個基因變異的頻率、基因功能、遺傳方式、文獻報道等信息，結合患者的臨床表型信息，篩選候選突變。

3.Sanger測序驗證：從UCSC Genome Bioinformatics數據庫（http：//genome.ucsc.edu）中提取TYR基因相關序列作為參考序列，針對候選突變的位點，用Primer Premier 5.0軟件設計引物，用于擴增TYR基因c.534G＞C突變的引物序列為TYR?E1?4F：5′?CATCTTCGATTTGAGTG CCC?3′，TYR?E1?4R：5′?CCCTGCCT GAAGAAGTGATT?3′；用于擴增c.1147G＞A突變的引物序列為TYR?E3?F：5′?AGTTATAAATCAAA TGGGATAATCA?3′，TYR?E3?R：5′?ACATTTGATAGGCACCCTCT ?3′。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以基因組DNA為模板進行擴增，擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，Sanger測序驗證。

圖1 眼皮膚白化病家系圖 a：16周未出生胎兒

4.氨基酸進化保守性分析：從UCSC Genome Bioinformatics數據庫（http：//genome.ucsc.edu）中提取人、小鼠、大鼠、斑馬魚和兔的TYR基因對應的氨基酸序列，使用ClustalX2.1軟件（http：//www.clustal.org）進行多序列比對，觀察錯義突變位點編碼的氨基酸在5個不同物種間的進化保守性。

5.羊水TYR基因產前檢測：孕20周時，對先證者母親進行羊膜腔穿刺術，并抽取25 ml羊水進行染色體核型分析和TYR基因突變位點檢測。

三、結果

靶向二代測序結果顯示，先證者TYR基因存在2個雜合變異，分別是 Exon1：c.534G ＞ C（p.Trp178Cys）和 Exon3：c.1147G＞A（p.Asp383Asn）。其中c.534G＞C突變引起所編碼蛋白質的第178位氨基酸由Trp突變為Cys；HGMD、ESP6500、dbSNP和千人基因組數據庫均未收錄該變異。c.1147G＞A突變引起所編碼蛋白質的第383位氨基酸由Asp突變為Asn；ESP6500和千人基因組數據庫均未收錄該變異，dbSNP數據庫有收錄（rs121908011），A等位基因頻率為0.000 164 73。

圖2 TYR基因突變位點測序結果 先證者第1外顯子發生突變c.534G＞C（2A），第3外顯子發生突變c.1147G＞A（2B）；先證者父親攜帶突變c.534G＞C（2C），先證者母親攜帶突變c.1147G＞A（2D）。箭頭所指為發生突變堿基

根據常染色體隱性遺傳病的遺傳規律，對先證者父母進行TYR基因突變位點檢測（圖2），證實先證者c.534G＞C變異來自父親，c.1147G＞A變異來自母親。利用Polyphen?2軟件對c.534G＞C（p.Trp178Cys）進行錯義變異的生物信息學分析，結果顯示，該突變為“probably damaging”，分數為1.0。多物種氨基酸序列分析顯示，c.534G＞C位點所編碼的氨基酸在所分析的5種生物中具有高度進化保守性（圖3）。

圖3 TYR基因突變位點在5個不同物種間的氨基酸進化保守性分析 黑色方框所在位置為突變c.534G＞C（p.Trp178Cys）對應的密碼子，*表示該位點在物種間高度保守

對先證者母親本次妊娠的胎兒進行羊水穿刺、染色體核型分析顯示，胎兒染色體正常，為TYR基因c.1147G＞A突變雜合子，未遺傳父親的突變位點。

四、討論

白化病具有高度遺傳異質性。采用傳統的Sanger測序技術對遺傳異質性高的疾病基因診斷，存在測序效率低、成本高、測序通量低、難以滿足多個基因測序需求的缺點。二代測序技術，也稱為大規模平行測序（massively parallel DNA sequencing），其基本原理是邊合成邊測序，即通過捕捉新合成的末端標記來確定DNA序列，構建測序文庫、錨定橋接、預擴增、單堿基延伸測序和數據分析等步驟，更全面、深入地分析基因組、轉錄組及蛋白質之間交互作用等各項數據［2］。二代測序包括全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）、全外顯子測序（whole exome sequencing，WES）、靶向基因測序（targeted gene sequening，TGS）［2］。本研究采用靶向二代測序的方法，對該家系的先證者進行29個白化病相關基因檢測，在TYR基因檢測到先證者2個雜合變異，經Sanger測序驗證結果準確無誤。

TYR基因位于11q14.3，由5個外顯子和4個內含子組成，其編碼的酪氨酸酶具有酪氨酸羥化酶活性，是黑素合成過程的關鍵酶［3］。TYR基因突變引起的眼皮膚白化病屬于OCA1型，以常染色體隱性遺傳方式遺傳，患者的父母往往均攜帶致病突變。OCA1型又分為OCA1A和OCA1B，后者隨年齡增長，色素可能會有所增加［4］。本文先證者眉毛和虹膜色素較出生時稍有增加，應屬于OCA1B型白化病。

錯義突變是OCA1型患者最常見的突變類型，大部分突變都位于該基因的4個區域［5?6］。本研究中先證者的2個雜合突變，分別是Exon1：c.534G＞C和Exon3：c.1147G＞A，均為錯義突變，其中c.534G＞C突變未見文獻報道，c.1147G＞A為已報道突變。c.534G＞C突變所在的區域為突變熱點區域，該區域已報道的突變包括 c.533G ＞ A［7］、c.535A ＞ T［8］、c.538C ＞ A［8］、c.539A ＞ G［9］。同源序列比對分析顯示，c.534G＞C突變引起的氨基酸改變發生于1個高度保守的氨基酸殘基上。先證者的2個TYR基因突變均處于酪氨酸酶的Cu2+結合區，分別位于CuA和CuB結構域，很可能影響了酪氨酸酶的Cu2+結合活性，從而降低該酶的活性，影響黑素的形成，導致OCA1發生［9］。先證者父母分別是上述兩種致病突變的雜合攜帶者。c.534G＞C突變在HGMD、ESP6500、dbSNP和千人基因組數據庫中均未被收錄，其位于突變熱點區域，為新發變異，并在父親中得到驗證，生物信息學分析顯示該突變為“probably damaging”，根據美國醫學遺傳學與基因組學學會（ACMG）對基因突變的解讀標準及指導原則，綜合考慮該突變為致病性突變。攜帶致病突變的父母每次生育子女均有25%的可能為白化病患者。夫婦雙方均為攜帶者的家庭再次妊娠時需做白化病產前基因診斷，以避免再次生育類似病情的患兒。

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Mutation analysis in a pedigree with oculocutaneous albinism

Hu Suwei,He Xiaoyan,Li Jie,Zhu Xiangyu,Xu Guijiang,Zhang Po
Medical Genetic Center,Yangzhou Maternal and Child Care Service Centre,The Affiliated Hospital of Yangzhou University Medical College,Yangzhou 225002,Jiangsu,China（Hu SW,He XY,Xu GJ,Zhang P）;Department of Obstetrics and Gynecology,Nanjing Drum Tower Hospital,The Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School,Nanjing 210008,China（Li J,Zhu XY）

Hu Suwei,Email:husuwei2004@126.com

ObjectiveTo investigate gene mutations in a pedigree with oculocutaneous albinism by using targeted next?generation sequencing technology.MethodsClinical data were collected from a pedigree with oculocutaneous albinism.Genomic DNA was extracted from peripheral blood cells of the proband and his parents.High?throughput sequencing technology was used for sequence analysis of coding regions in exons of 29 genes including TYR,OCA2,TYRP1 and SLC45A2 in the proband to find potential pathogenic gene mutations.Sanger sequencing was conducted to detect the corresponding genetic loci in the parents.ResultsTwo heterozygous mutations were identified in the TYR gene of the proband,including a novel mutation c.534G ＞ C（p.Trp178Cys）and a known mutation c.1147G ＞ A（p.Asp383Asn）.The detection of the TYR gene mutations in the parents of the proband showed that the c.534G＞C and c.1147G＞A mutations in the proband were inherited from his father and mother respectively.ConclusionA novel pathogenic mutation c.534G＞C in the TYR gene is identified in the pedigree with oculocutaneous albinism by using targeted next?generation sequencing technology.

Albinism,oculocutaneous;Genotyping techniques;Mutation;Prenatal diagnosis

Fund programs:Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China（BK20140101）;Maternal and Child Health Research Project of Jiangsu Province（F201672）;Yangzhou Science and Technology Planning Project（YZ2016064）

胡蘇瑋，Email：husuwei2004@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.12.011

江蘇省自然科學基金（BK20140101）；江蘇省婦幼健康科研項目（F201672）；揚州市科技計劃項目（YZ2016064）

2016?12?08）

朱思維 顏艷）