維生素D受體基因多態性與尋常性銀屑病易感性及卡泊三醇療效的相關性

劉軍麟 曾慧明 林岷格 鞠梅 吳智明 李梅嬌 李毓陽 殷梅

570311海口，海南醫學院第二附屬醫院皮膚性病科（劉軍麟），檢驗科（吳智明），體檢中心（殷梅）；海南醫學院第一附屬醫院皮膚性病科（曾慧明、林岷格）；中國醫學科學院北京協和醫學院 皮膚病研究所理療科（鞠梅）；海南省中醫院皮膚性病科（李梅嬌）；海南省第三人民醫院皮膚性病科（李毓陽）

·論著·

維生素D受體基因多態性與尋常性銀屑病易感性及卡泊三醇療效的相關性

劉軍麟 曾慧明 林岷格 鞠梅 吳智明 李梅嬌 李毓陽 殷梅

570311海口，海南醫學院第二附屬醫院皮膚性病科（劉軍麟），檢驗科（吳智明），體檢中心（殷梅）；海南醫學院第一附屬醫院皮膚性病科（曾慧明、林岷格）；中國醫學科學院北京協和醫學院 皮膚病研究所理療科（鞠梅）；海南省中醫院皮膚性病科（李梅嬌）；海南省第三人民醫院皮膚性病科（李毓陽）

目的探討維生素D受體（VDR）基因多態性與尋常性銀屑病易感性及卡泊三醇軟膏療效的關系。方法收集110例尋常性銀屑病患者與183例健康對照，均為海南籍漢族人，采用連接酶檢測反應對受試者rs2228570、rs731236、rs1544410及rs7975232位點基因分型，進行基于單核苷酸多態性和單倍型的病例-對照聯分析。75例銀屑病面積和嚴重程度指數（PASI）＜10的患者單用卡泊三醇軟膏治療，6周后評估其療效，并與個體的基因型進行關聯分析。結果銀屑病組rs7975232位點等位基因A的頻率為39.09%，對照組為27.05%，攜帶該等位基因的個體患病風險高于非攜帶者（OR=1.731，95%CI:1.213～2.471，P＜0.05）；AA基因型與AC基因型個體患病風險高于CC基因型個體（分別為 OR=2.404，95%CI：1.085 ～ 5.328，P＜ 0.05；OR=2.143，95%CI：1.283 ～ 3.579，P＜0.05）。攜帶CTGA（分別對應 rs2228570、rs731236、rs1544410、rs7975232位點）單倍體的個體患病風險高于非攜帶者（OR=1.907，95%CI：1.132～3.214，P＜ 0.05）。在72例PASI＜10的輕、中度銀屑病患者中，卡泊三醇對rs7975232位點為CC基因型患者的療效好于AC基因型患者（OR=3.798，95%CI:1.061～13.590，P＜0.05）和AA基因型患者（OR=9.667，95%CI:1.556～60.040，P＜0.05）。結論尋常性銀屑病患病風險及卡泊三醇療效差異與維生素D受體基因多態性相關。

銀屑病；受體，骨化三醇；多態性，單核苷酸；單倍型；卡泊三醇

銀屑病是常見遺傳性疾病，其特征是角質形成細胞的過度增殖和角化不全［1］。1，25二羥維生素D3是維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）的配體。激素-受體復合體結合激素反應元件后，可抑制培養的角質形成細胞增殖，誘導其分化，并通過多種途徑調節免疫系統［2］。VDR基因位于12q13.11，約有200多個單核苷酸多態（single nucleotide polymorphisms，SNP）［3］。迄今為止，有多個研究探索VDR基因與銀屑病的關系，其中大部分研究集中在rs2228570：C＞T（外顯子2起始編碼區）、rs1544410：G ＞ A（內含子8）、rs7975232：T ＞ G（內含子8）和rs731236：T ＞ C（外顯子9）位點。這4個位點可通過限制性片段長度多態性的方法分別用內切酶FokⅠ、BsmIⅠ、ApaⅠ和TaqⅠ進行酶切識別，因而又習慣性分別命名為FokⅠ、BsmⅠ、ApaⅠ和TaqⅠ位點［4］。本研究探討VDR基因rs2228570：C ＞ T、rs1544410：G ＞ A、rs7975232：T ＞ G 和rs731236：T＞C位點與尋常性銀屑病發病以及維生素D類似物卡泊三醇軟膏療效的相關性。

對象與方法

一、對象

海南醫學院第二附屬醫院、海南醫學院第一附屬醫院皮膚科門診和病房的海南籍漢族尋常性銀屑病患者110例，其中男67例，女43例，年齡8～75（35.27±14.96）歲。從海南醫學院第二附屬醫院體檢中心收集海南籍漢族健康體檢人員183例（男104例，女79例）作為健康對照，年齡10～ 67（33.83± 13.26）歲，健康對照及其家庭成員均無銀屑病史，且與入選的銀屑病患者無血緣關系。兩組的性別和年齡差異無統計學意義（P值分別為0.493、0.392）。本研究通過海南醫學院第二附屬醫院醫學倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。

二、方法

1.SNP分型：采用連接酶檢測反應（ligase detection reactions，LDR）進行SNP分型。采集受試者外周靜脈血，用基因組DNA提取試劑盒（美國Axygene公司）提取基因組DNA進行多重PCR擴增，反應體系（20 μl）：50 ng/L模板DNA 1 μl，1 × 緩沖液 2 μl，3 mmol/L MgCl20.6 μl，2 mmol/L dNTP 2 μl，Taq酶1 U，0.5 μmol/L混合引物2 μl，不足部分用雙蒸水補充；反應程序：95℃預變性2 min，94℃變性30 s，65℃退火30 s，65℃延伸30 s，40個循環后65℃延伸10 min。擴增后進行連接反應，反應體系（10 μl）：1 × 緩沖液1 μl，2 μmol/L混合探針各1 μl，Taq酶2 U，PCR產物4 μl，不足部分用雙蒸水補充；反應程序：95℃預變性2 min，94℃變性15 s，50℃延伸25 s，共40個循環。由ABI 377測序儀完成SNP分型，并用Genemapper軟件分析。為保證分型結果的正確性，隨機抽取每種基因型的樣本進行直接測序驗證。PCR反應引物、LDR探針由上海翼和應用生物技術有限公司合成，序列見表1、2。

表1 維生素D受體基因4個位點的PCR引物序列

2.銀屑病病情評估及治療：對110例患者進行銀屑病面積和嚴重程度指數（psoriasis area and severity index，PASI）評分，PASI＜ 10且符合下列條件的輕、中度銀屑病患者納入卡泊三醇軟膏治療組：①初發患者，近1個月未因銀屑病或其他疾病接受糖皮質激素類、維生素D類似物或維A酸類等對銀屑病具有治療作用的藥物外用治療；②近1個月未使用且之后6周不需系統應用糖皮質激素類、維A酸類藥物、復方甘草酸苷、甘草酸二銨、雷公藤多苷或免疫抑制劑。治療方法：皮損處外用卡泊三醇軟膏2次/d，若有必要可加用保濕劑，不系統使用或外用其他對銀屑病有治療作用的藥物。6周后評估療效，PASI評分改善75%及以上評定為有效。

3.統計分析：采用PLINK 1.07軟件，進行基于SNP和單倍型的病例-對照關聯分析，在對照人群中進行Hardy?Weinberg平衡檢驗。卡泊三醇軟膏對VDR不同基因型患者療效的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

表2 維生素D受體基因4個位點的連接酶檢測反應探針序列

表3 維生素D受體基因4個位點在尋常性銀屑病患者組和健康對照組中的基因型和等位基因頻率［n（%）］

結 果

一、SNP和單倍型的病例-對照關聯分析結果

兩組rs731236、rs1544410、rs7975232、rs2228570位點基因型和等位基因頻率見表3。隨機抽取每種基因型各1例進行直接測序驗證，其結果與LDR分型結果一致。對照組中4個位點的基因型均符合Hardy?Weinberg平衡（HWEP值分別為 0.647、0.080、0.328、0.369）。rs7975232（C ＞ A）位點上，攜帶等位基因A的個體，其尋常性銀屑病的患病風險高于非攜帶者（P=0.003 3）；攜帶AA基因型與AC基因型的個體尋常性銀屑病的患病風險高于攜帶CC基因型者（P值分別為 0.0340、0.0045）。在rs2228570（T ＞ C）、rs1544410（G ＞ A）、rs731236（C ＞T）位點上，不同基因型和等位基因的個體之間尋常性銀屑病的患病風險差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

基于單倍型的分析結果顯示，頻率＞5%的單倍型有4種，分別為TTGA（分別對應rs2228570、rs731236、rs1544410、rs7975232位點）、CTGA、TTGC、CTGC型，其中CTGA型在患者組和對照組中的頻率分別為14.78%和8.47%，攜帶CTGA單倍型的個體患病風險高于非攜帶者，差異有統計學意義（OR=1.907，95%CI：1.132 ～ 3.214，P=0.019 5）。

二、卡泊三醇軟膏對尋常性銀屑病的療效

110例尋常性銀屑病患者中，75例PASI＜10，為輕、中度銀屑病患者，單用卡泊三醇軟膏治療6周，72例完成隨訪，其中53例有效，19例無效。在4個位點中，rs7975232位點基因型CC、AC、AA的頻率在有效和無效患者中的分布差異有統計學意義（P＜0.05），且攜帶rs7975232 CC基因型的患者（22例）對卡泊三醇軟膏的療效好于攜帶AC基因型（32例，P=0.042）和AA基因型（7例，P=0.020）患者。而其他3個位點不同基因型患者的療效差異均無統計學意義。見表4。

表4 72例PASI＜10的輕、中度銀屑病患者VDR基因4個位點基因型與卡泊三醇軟膏療效的關系［例（%）］

討 論

1997年，Kontula等［5］通過對VDR基因與銀屑病發病的關聯分析發現rs1544410不是銀屑病的易感位點。之后，Park等［6］報道，rs7975232可能是韓國人尋常性銀屑病的易感位點；而Lee等［7］報道，rs1544410不是韓國人尋常性銀屑病的易感位點。來自日本的一項研究顯示，rs1544410、rs731236是銀屑病的易感位點［8］；另一個來自日本的研究則排除了rs7975232、rs1544410和rs731236位點［9］。來自中國的研究顯示，在華東人群中，rs7975232、rs1544410是銀屑病的易感位點［10］；而在東北人群中，只有rs7975232是銀屑病的易感位點［11］。本研究中，尋常性銀屑病患者rs7975232等位基因A頻率高于對照組，攜帶等位基因A的個體患病風險高于不攜帶者；相對于CC基因型，AC或AA基因型個體銀屑病患病風險更高。本研究與前述的國內研究結果類似。但在東亞或世界范圍內，針對同一個基因甚至同一個SNP的關聯分析，其結果可能不完全一致。

本研究還進行了基于單倍型的關聯分析，結果顯示，攜帶CTGA（rs2228570、rs731236、rs1544410、rs7975232位點）單倍型的個體尋常性銀屑病的患病風險更高。此結果與Zhou等［11］的報道即3個位點構 建 的 單 倍 型 GCT（rs1544410、rs7975232、rs731236）攜帶者銀屑病患病風險降低類似；另一項德國研究證實，該單倍型與重度特應性皮炎關聯［12］。克羅地亞的研究則顯示，任何包含rs1544410、rs7975232或rs731236的單倍型均與銀屑病發病風險相關［13］。上述結果提示，不同國家間單倍型的研究結果也不完全一致，因而，需要進行功能研究，以探索等位基因或單倍型變異是否可能對VDR基因的生物學功能產生影響。

Morrison等［14］報道，等位基因b可能降低VDR mRNA的表達。另有報道稱，等位基因F的轉錄效率比等位基因f更高［15］。Colin等［16］報道，在植物血凝素刺激的外周血單核細胞生長阻斷實驗中，用1，25-二羥維生素D3刺激時，FF基因型個體的半數有效量低于Ff基因型。而對于單倍型，有報道認為，baT和BAt與等位基因的特異表達、VDR mRNA降解、巨噬細胞功能以及Th1/Th2細胞因子分化均有關［17?19］。Heine等［12］研究亦顯示，在嚴重特應性皮炎患者中（rs1544410/rs7975232/rs731236）GCT純合子較AAC攜帶者對骨化三醇所致的VDR激活過程更敏感，VDR mRNA水平更高。本研究證實，rs7975232等位基因A是尋常性銀屑病的風險等位基因。rs7975232位于內含子8，推測其可能通過改變RNA剪接、編輯或通過影響受體蛋白折疊以及與DNA反應元件的親和力而改變其功能，從而導致個體對銀屑病易感。在rs7975232位點上，對CC基因型的尋常性銀屑病患者，卡泊三醇軟膏的療效好于攜帶其他基因型的個體。本研究的結果提示，rs7975232等位基因A是銀屑病的風險等位基因，而等位基因C則可能是銀屑病的保護基因。維生素D類似物對具有rs7975232 CC基因型的個體具有更好的療效這一現象與等位基因C是銀屑病的保護基因這一結果是否緣于同一機制尚不清楚，確切的機制尚需后續的實驗探索。

綜上所述，rs7975232可能是尋常性銀屑病的易感位點，rs2228570/rs731236/rs1544410/rs7975232 CTGA是銀屑病的風險單倍型，卡泊三醇對rs7975232位點為CC基因型的個體療效更好。但是，本研究樣本量有限，后續研究應增加樣本量，以使結果更具說服力。

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Association of vitamin D receptor polymorphisms with susceptibility to psoriasis vulgaris and clinical response to calcipotriol in patients with psoriasis vulgaris

Liu Junlin,Zeng Huiming,Lin Min′ge,Ju Mei,Wu Zhiming,Li Meijiao,Li Yuyang,Yin Mei
Department of Dermatology and Venereology,The Second Affiliated Hospital of Hainan Medical University,Haikou 570311,China（Liu JL）;Clinical Laboratory,The Second Affiliated Hospital of Hainan Medical University,Haikou 570311,China（Wu ZM）;Health Examination Center,The Second Affiliated Hospital of Hainan Medical University,Haikou 570311,China（Yin M）;Department of Dermatology and Venereology,The First Affiliated Hospital of Hainan Medical University,Haikou 570102,China（Zeng HM,Lin MG）;Department of Physical Therapy,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Ju M）;Department of Dermatology and Venereology,Chinese Medicine Hospital of Hainan Province,Haikou 570203,China（Li MJ）;Department of Dermatology and Venereology,The Third People′s Hospital of Hainan Province,Sanya 572000,China（Li YY）

Liu Junlin,Email:liujunlin0759@163.com

ObjectiveTo investigate association of vitamin D receptor（VDR）polymorphisms with susceptibility to psoriasis vulgaris and clinical response to calcipotriol in patients with psoriasis vulgaris.MethodsA total of 110 patients with psoriasis vulgaris and 183 healthy controls were enrolled into this study,and they were all of Han nationality from Hainan province.Ligase detection reaction（LDR）was conducted to determine the genotypes of VDR gene polymorphisms rs2228570,rs731236,rs1544410 and rs7975232.Single nucleotide polymorphism（SNP）?based association analysis in genotypic and allelic models,and haplotype?based association analysis were then performed.Then,75 patients with psoriasis area and severity index（PASI）scores less than 10 were topically treated with calcipotriol ointment alone.After 6?week treatment,the efficacy of calcipotriol ointment was evaluated,and the correlation between the efficacy and individual genotypes was analyzed.ResultsThe frequency of A allele of rs7975232 in the psoriasis group and control group was 39.09%and 27.05%respectively,and the risk of developing psoriasis in rs7975232 A allele carriers was significantly higher than that in non?carriers（OR=1.731,95%CI:1.213-2.471,P＜ 0.05）.Additionally,the risk of developing psoriasis in individuals with AA genotype（OR=2.404,95%CI:1.085-5.328,P＜ 0.05）,as well as in individuals with AC genotype（OR=2.143,95%CI:1.283-3.579,P＜ 0.05）,was significantly higher than that in patients with CC genotype.CTGA haplotype carriers（rs2228570,rs731236,rs1544410,rs7975232,respectively）had significantly higher risk of developing psoriasis compared with non?carriers（OR=1.907,95%CI:1.132-3.214,P＜ 0.05）.Among 72 patients with mild?to?moderate psoriasis whose PASI scores were less than 10,patients with CC genotype of rs7975232 showed better response to calcipotriol ointment compared with those with AC genotype（OR=3.798,95%CI:1.061-13.590,P＜ 0.05）and those with AA genotype（OR=9.667,95%CI:1.556-60.040,P＜ 0.05）.ConclusionVDR polymorphisms are associated with psoriasis susceptibility and clinical response to calcipotriol in patients with psoriasis individuals.

Psoriasis;Receptors,calcitriol;Polymorphism,single nucleotide;Haplotypes;Calcipotriol

Fund program:Natural Science Foundation of Hainan Province of China（814344）

劉軍麟，Email：liujunlin0759@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.12.007

海南省自然科學基金（814344）

2017?05?31）

朱思維 顏艷）