腫瘤壞死因子α基因啟動子多態性與泛發性膿皰性銀屑病相關性研究

龍福泉 劉業強 錢伊弘 蒙秉新 趙麗詩 王千秋

200043上海市皮膚病醫院性病科（龍福泉、錢伊弘、趙麗詩），病理科（劉業強）；海南省人民醫院皮膚科（蒙秉新）；中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病研究所性病臨床防治室（王千秋）

·論著·

腫瘤壞死因子α基因啟動子多態性與泛發性膿皰性銀屑病相關性研究

龍福泉 劉業強 錢伊弘 蒙秉新 趙麗詩 王千秋

200043上海市皮膚病醫院性病科（龍福泉、錢伊弘、趙麗詩），病理科（劉業強）；海南省人民醫院皮膚科（蒙秉新）；中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病研究所性病臨床防治室（王千秋）

目的探討腫瘤壞死因子α（TNF?α）基因啟動子區域多態性與泛發性膿皰性銀屑病的相關性。方法檢測對象為91例漢族泛發性膿皰性銀屑病患者及102例漢族健康體檢者，應用PCR及直接測序法分析TNF?α基因啟動子區域?238、?308、?857位點多態性。結果泛發性膿皰性銀屑病患者與健康對照組TNF?α?238位點G/A等位基因頻率差異有統計學意義（P=0.003；OR=4.819，95%CI：1.581～14.694），基因型GG與GA/AA在兩組間的分布差異也有統計學意義（P=0.006；OR=4.455，95%CI：1.410～ 14.077）；TNF?α?308位點G/A等位基因頻率以及基因型GG與GA/AA的分布在兩組間差異無統計學意義（P值分別為0.794、0.786）；TNF?α?857位點C/T等位基因頻率以及基因型CC與CT/TT的分布在兩組間差異無統計學意義（P值分別為0.474、0.453）。結論TNF?α?238G＞A多態性可能與泛發性膿皰性銀屑病發病相關。

銀屑病；腫瘤壞死因子α；多態性；單核苷酸；轉錄啟動子；泛發性膿皰性銀屑病

泛發性膿皰性銀屑病（generalized pustular psoriasis，GPP）是銀屑病的一種嚴重類型，發病機制尚不明確。研究發現，遺傳易感因素在GPP發病機制中起到一定作用［1?2］。既往研究表明，腫瘤壞死因子α（TNF?α）基因啟動子區域存在多態性位點，TNF?α?238G ＞ A（rs361525）、?308G ＞ A（rs1800629）及?857C＞T（rs1799724）多態性與尋常性銀屑病及銀屑病性關節炎相關［3?4］。我們采用PCR及DNA直接測序檢測GPP與TNF?α基因啟動子區域多態性位點的相關性，探討GPP的遺傳發病機制。

對象與方法

一、對象

2010年9月至2012年6月分別在中國醫學科學院皮膚病醫院、海南省人民醫院收集漢族GPP患者91例，其中男61例，女30例，年齡5～62（24.0±10.6）歲。診斷標準參照文獻［5］，患者之間無血緣關系。對照組為102例漢族健康體檢者，無遺傳性、家族性疾病或嚴重系統性疾病，其中男67例，女35例，年齡11～58（26.7±9.0）歲。兩組之間性別（χ2=0.224，P＞ 0.05）及年齡（t=1.886，P＞ 0.05）差異均無統計學意義。樣本采集前均簽署知情同意書。

二、方法

采集受試者外周血2 ml，置于乙二胺四乙酸二鈉抗凝管中，-20℃凍存。使用血液基因組DNA快速抽提試劑盒［生工生物工程（上海）有限公司］提取并純化DNA，按照試劑盒說明操作。檢測質量和濃度后，將提取DNA稀釋為10 mg/L，-20℃保存。PCR引物設計參照文獻［6?7］，引物序列見表1。PCR反應體系（50 μl）含10 × 緩沖液5 μl，200 μmol/L dNTP 2 μl，P1、P2 引物（10 pmol/L）各 2 μl，小牛血清蛋白 2 μl，5 U/μl TaqDNA 聚合酶 0.25 μl，超純水36 μl，5 × DNA模板2 μl。短暫混勻后，置 PCR儀上，95℃預變性4 min，94℃變性1 min，64℃退火1 min，72℃延伸1 min，共40個循環，最后72℃再延伸10 min，4℃保溫。PCR擴增產物經15 g/L瓊脂糖凝膠電泳后紫外燈下檢測，使用小量膠回收試劑盒回收，最后將回收產物-20℃凍存備用。

表1 引物序列及產物長度

測序反應體系：回收PCR產物2 μl，Big DyeTM2 μl，1 pmol/L 引物 1 μl（采用 P1 作為測序反應引物）。混勻后，96℃10 s，50℃5 s，60℃ 4 min，共25個循環，4℃保溫。反應結束后，采用異丙醇法對產物進行純化，最后使用ABI Prism3700測序儀（美國Applied Biosystems公司）電泳、測序。對測序結果用DNA Star軟件包分析。

三、統計學方法

采用SPSS18.0軟件分析，計數資料采用χ2檢驗分析，計算比值比（OR）和95%可信區間（CI），以OR＞1為有病因學聯系。計量資料采用t檢驗分析，P＜0.05為差異有統計學意義。所有統計學檢驗均為雙側檢驗。

結 果

測序結果表明，GPP患者與健康對照組TNF?α啟動子區域存在?238G＞A、?308 G＞A及?857C＞T堿基突變，3個SNP位點的等位基因頻率以及基因型分布見表2。χ2檢驗顯示，GPP患者與健康對照TNF?α?238位點（rs361525）G/A等位基因頻率差異有統計學意義（P=0.003；OR=4.819，95%CI：1.581～14.694）；基因型GG與GA/AA在兩組間的分布差異亦有統計學意義（P=0.006；OR=4.455，95%CI：1.410 ～ 14.077）；TNF?α?308位 點（rs1800629）G/A等位基因頻率以及基因型GG與GA/AA的分布在兩組間差異均無統計學意義（P值分別為0.794、0.786）；TNF?α?857位點（rs1799724）C/T等位基因頻率以及基因型CC與CT/TT的分布在兩組間差異亦無統計學意義（P值分別為0.474、0.453）。

討 論

GPP是銀屑病較為嚴重的少見臨床類型，約占銀屑病患者的1.3%［8］。GPP病因及發病機制復雜，感染、藥物、糖皮質激素突然停藥、精神壓力、內分泌異常等因素可誘發該病［5］。Marrakchi等［9］對9 個突尼斯GPP家系患者進行純合子定位和直接測序，首次發現IL36RN可能是GPP的致病基因。Sugiura等［10］和 Berki等［11］發 現 ，CARD14c.526G ＞ C（p.Asp176His）雜合突變是尋常性銀屑病患者繼發GPP的一個重要易感因素。也有研究發現，TNIP1、CARD14堿基改變與GPP有關［2，12］。作為銀屑病的一個亞型，GPP顯示出其獨特的發病機制，同時也與尋常性銀屑病有類似的遺傳基礎。

表2 腫瘤壞死因子α（TNF?α）啟動子區不同位點等位基因及基因型在泛發性膿皰性銀屑病（GPP）患者與對照組中的頻率

TNF?α啟動子區域有多個多態性位點，Meta分析表明，TNF?α?238G＞A和?308G＞A多態性是尋常性銀屑病風險預測的生物學標記，并可能與疾病嚴重程度相關［3?4，13?14］。我們既往研究也表明，TNF?α?238G＞A與早發型尋常性銀屑病有關［15］。Nishibu等［16］研究6例GPP合并關節炎患者，1例發生TNF?α?308AA純合子突變，但限于病例較少，無法從統計學角度證明其相關性。

我們對91例GPP患者的研究表明，TNF?α?238位點多態性與GPP相關，TNF?α?238G＞A多態性可能是導致GPP的原因之一，但未發現?308 G＞A及?857C＞T多態性與GPP相關。將來仍需進行大規模、多種族的臨床研究，進一步揭示TNF?α啟動子區域多態性在GPP發生發展中的作用。另外，TNF?α基因在MHC中的位置特殊，TNF啟動子基因多態性與MHCⅠ類及Ⅱ類基因在GPP發病中是單獨起作用還是共同發揮作用，有待于進一步研究。同時，有資料表明，TNF?α?238G ＞ A、?308 G ＞ A及?857C＞T多態性改變與尋常性銀屑病患者對TNF?α阻斷劑的敏感性相關［17］。TNF?α啟動子區域?238G ＞ A多態性改變可能會誘導TNF?α高表達［7］，而TNF?α作為一種前炎癥細胞因子，可通過誘導炎癥反應參與GPP發病環節［18］。一些生物制劑尤其是TNF?α阻斷劑治療兒童頑固性GPP有較好療效［19?20］，進一步說明 TNF?α在 GPP致病機制中起到一定作用。因此，有必要進一步擴大樣本量，深入研究TNF?α啟動子基因多態性是否導致GPP患者產生異常活性的前炎癥細胞因子TNF?α，從而影響GPP進程，并進而評估臨床應用TNF?α阻斷劑治療對常規藥物抵抗的GPP患者的可行性，對GPP治療提供一個新的思路。

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Association of tumor necrosis factor?α gene promoter polymorphisms with generalized pustular psoriasis

Long Fuquan,Liu Yeqiang,Qian Yihong,Meng Bingxin,Zhao Lishi,Wang Qianqiu
Department of Venereology,Shanghai Dermatology Hospital,Shanghai 200043,China（Long FQ,Qian YH,Zhao LS）;Department of Pathology,Shanghai Dermatology Hospital,Shanghai 200043,China（Liu YQ）;Department of Dermatology,Hainan General Hospital,Haikou 570102,Hainan,China（Meng BX）;Department of Sexually Transmitted Disease Clinical Management,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Wang QQ）

Wang Qianqiu,Email:wangqq@ncstdlc.org

ObjectiveTo investigate the association of tumor necrosis factor?α（TNF?α）gene promoter polymorphisms with generalized pustular psoriasis.MethodsTotally,91 patients of Han nationality with generalized pustular psoriasis（generalized pustular psoriasis group）and 102 health checkup examinees（healthy control group）were enrolled into this study.PCR and direct sequencing were performed to analyze the ?238,?308 and ?857 polymorphic sites of the TNF?α promoter.ResultsThe frequency of the A allele at TNF?α?238 site was significantly higher in the generalized pustular psoriasis group than in the healthy control group（P=0.003,OR=4.819,95%CI:1.581-14.694）,so was the frequency of GA/AA genotype（P=0.006,OR=4.455,95%CI:1.410-14.077）.However,no significant differences were observed in the frequencies of G/A alleles（P=0.794）and GG/GA/AA genotypes（P=0.786）at TNF?α?308 site,or in the frequencies of C/T alleles（P=0.474）and CC/CT/TT genotypes（P=0.453）at TNF?α?857 site,between the generalized pustular psoriasis group and healthy control group.ConclusionTNF?α?238G ＞ A polymorphisms may be associated with the occur?rence of generalized pustular psoriasis.

Psoriasis;Tumor Necrosis Factor?alpha;Polymorphism,single nucleotide;Transcrip?tion Initiation Site;Generalized pustular psoriasis

Fund programs:Shanghai Municipal Natural Science Foundation（14ZR143700）；Natural Science Foundation of Hainan Province of China（813219）

王千秋，Email：wangqq@ncstdlc.org

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.12.005

上海市自然科學基金（14ZR143700）；海南省自然科學基金（813219）

2017?03?03）

尚淑賢）