甘草藥渣降解菌的篩選及其產酶工藝研究

曾飛 張森 錢大瑋 朱振華 周嘉琳 段金廒

（1. 南京中醫藥大學 江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心 中藥資源產業化與方劑創新藥物國家地方聯合工程研究中心 國家中醫藥管理局中藥資源循環利用重點研究室，南京 210023；2. 江蘇天江藥業有限公司，江陰 214400）

甘草藥渣降解菌的篩選及其產酶工藝研究

曾飛1張森1錢大瑋1朱振華1周嘉琳2段金廒1

（1. 南京中醫藥大學 江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心 中藥資源產業化與方劑創新藥物國家地方聯合工程研究中心 國家中醫藥管理局中藥資源循環利用重點研究室，南京 210023；2. 江蘇天江藥業有限公司，江陰 214400）

篩選能夠有效降解甘草藥渣的菌株，優化菌株的纖維素酶生產工藝。從腐爛的甘草及土壤中篩選甘草藥渣降解菌，結合形態學觀察及18S rDNA測序確定菌株的分類地位；考察了不同因素對菌株發酵的影響；采用L9（34）正交分析法確定菌株最佳產酶條件；利用菌株生產的纖維素酶對甘草藥渣進行酶解研究。確定分離菌株為Penicillium oxalicum，命名為草酸青霉G2。正交分析結果表明，藥渣含量、發酵時間對G2的發酵有顯著影響（P＜0.05，P＜0.05）；在最佳產酶工藝條件下，測得G2濾紙酶活力3.43 U /mL、內切酶活力16.89 U /mLu；甘草藥渣的酶解結果表明，G2生產的纖維素酶（G2酶）對甘草藥渣的酶解效率優于商品酶。此外，甘草藥渣經酶解以后，甘草總黃酮提取率明顯升高。對甘草藥渣降解菌的篩選以及對菌株的產酶工藝研究，旨在為合理利用甘草藥渣以及生產成本低廉、性能優良的纖維素酶奠定基礎。

甘草藥渣；纖維素酶；草酸青霉

纖維素酶在生物乙醇的生產過程中具有重要作用。但纖維素酶生產成本較高，在一定程度上限制了生物能源行業的發展［1］。目前，工業上常采用液體發酵法生產纖維素酶，其中原材料就占到了生產成本的40%-60%［2］。可見控制原材料的成本可以有效地降低纖維素酶的生產成本。此外，工業上還通過篩選高產菌株來控制生產成本［3］。

我國每年大概產生3 000萬t左右的中藥藥渣。中藥藥渣的大量排放，已經對環境造成了嚴重的破壞，同時也嚴重制約了中藥產業的發展［4］。目前，藥渣過剩的問題已經引起了越來越多的關注。特別是利用生物發酵技術對藥渣進行再利用研究，已經成為目前的研究熱點。如敖楊等［5］利用生物發酵將金蓮花藥渣轉化為飼料添加劑，其可以顯著改善肉雞的生產性能。黃凡等［6］利用黑曲霉固態發酵三七藥渣生產纖維素酶。

甘草是臨床上常用藥，每年僅其制劑及提取物的消耗量就達近萬噸，也因此產生了大量的廢棄甘草藥渣［7］。研究發現，甘草藥渣不僅可以作為提取藥用活性成分的原料，還可以作為廉價的生物質資源。甘草藥渣中除含有豐富藥用活性成分外［8-9］，其纖維素、半纖維素及木質素的含量分別達到17.4%、16.95%和9.54%［10］。近年來，關于甘草藥渣的研究主要是對其生物活性物質的再利用研究，如張娟等［11］利用甘草藥渣制備甘草查爾酮A；方詩琪等［7］從甘草藥渣中分離出具有抗氧化活性的物質。但甘草藥渣在提取有效成分以后，其殘余的固體物質仍會對環境造成污染。由此可見，僅利用甘草藥渣的有效成分，仍不能有效的處置甘草藥渣。因此，需要對甘草藥渣中的有效成分和纖維素資源進行綜合利用，尤其是纖維素資源的再利用研究。本實驗的主要目的是篩選能夠有效降解甘草藥渣的菌株，確定菌株的最佳產酶工藝，同時研究該酶對甘草藥渣的降解效率，以及酶解后藥渣中藥用活性成分提取率的變化。旨在合理處置甘草藥渣，同時生產成本低廉、性能良好的纖維素酶。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 草酸青霉G2由本實驗室從腐爛的甘

草植株（甘肅定西）中分離得到。

1.1.2 甘草藥渣 甘草藥渣由江陰天江藥業提供，經南京中醫藥大學段金廒教授鑒定為烏拉爾甘草藥渣。甘草藥渣經自然風干、烘干、粉碎、過60目篩后，置于干燥器中備用。

1.1.3 培養基 選擇培養基：（NH4）2SO43 g/L、尿素0.3 g/L、KH2PO42 g/L、甘草藥渣50 g/L、MgSO40.5 g/L ；CMC-Na平板 ：（NH4）2SO43 g/L、尿素 0.3 g/L、KH2PO42 g/L、MgSO40.5 g/L、CMC-Na 10 g/L、瓊脂15 g/L；PDA培養基：土豆200 g/L、葡萄糖10 g/L、瓊脂15 g/L；種子培養基：酵母膏1 g/L、葡萄糖1 g/L、（NH4）2SO43 g/L、尿素 0.3 g/L、KH2PO42 g/L ；初始發酵培養基：甘草藥渣、（NH4）2SO43 g/L、尿素0.3 g/L、KH2PO42 g/L、MgSO40.5 g/L、0.1%金屬離子（FeSO4·7H2O 0.005 g/L、MnSO4·H2O 0.001 6 g/L、ZnSO4·7H2O 0.001 4 g/L、CoCl20.002 g/L）、0.1% 吐溫-80。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選與鑒定 菌株篩選：取腐爛的甘草或土壤1 g。將其分別置于以藥渣為唯一碳源的選擇培養基上進行富集，30℃、培養48 h。再將培養液適當的稀釋，并涂抹到CMC-Na平板上，30℃、培養72 h。剛果紅染色，挑選透明圈較明顯的菌落置于PDA平板上進行純化。同時，對純化后的菌株進行液體發酵復篩。菌株的鑒定：對復篩后的菌株，進行形態學觀察，同時外出送樣進行測序。

1.2.2 培養方法 斜面培養：將菌株劃線接種于PDA斜面，30℃培養48 h。種子培養：每支斜面加5 mL無菌水，取1 mL接入種子培養基中，轉速180 r/min，30℃、培養24 h。發酵培養：250 mL三角瓶中裝入發酵培養基80 mL，按5%接種量接入種子培養液，轉速180 r/min搖床培養。

1.2.3 酶活測定 發酵液經4 000 r/min離心30 min，收集上清液即為粗酶液。參照文獻［12］，粗酶液經適當稀釋后，采用DNS比色法，測定濾紙酶、內切酶活力。參照文獻［13］，粗酶液經適當稀釋后，測定β-葡萄糖苷酶活。（1 mL酶液在pH4.8、50℃恒溫水浴條件下水解底物，1 min內生成1 μmol 葡萄糖定義為一個酶活單位，用U/mL表示。）

1.2.4 草酸青霉G2產酶條件分析 分別考察藥渣含量、初始pH、發酵溫度、發酵時間、原材料預處理方式等因素對草酸青霉G2液體發酵的影響，并測量各發酵液的纖維素酶活力。

1.2.4.1 藥渣含量對酶活的影響 在初始發酵培養基中分別添加1%、3%、5%、7%、9%、11%的甘草藥渣，其它條件不變，30℃、自然pH發酵120 h。1.2.4.2 初始pH對酶活的影響 在單因素實驗1.2.4.1的結果下，將發酵培養基的pH分別調至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，30℃發酵 120 h，測量各發酵液的纖維素酶活性。

1.2.4.3 發酵溫度對酶活的影響 在單因素實驗1.2.4.1和1.2.4.2的結果下，發酵溫度分別為20、25、30、35、40℃的條件下培養120 h，測量各發酵液的纖維素酶活性。

1.2.4.4 發酵時間對酶活的影響 在單因素實驗1.2.4.1-1.2.4.3的結果下，分別發酵24、48、72、96、120、144、168、192 h，測量各發酵液的纖維素酶活性。

1.2.4.5 原材料預處理方式對酶活的影響 以分別經過超聲2 h、5% NaOH靜置24 h、5% NaOH超聲2 h處理的甘草藥渣為基質配制培養基。在發酵培養基起始pH6.0、藥渣含量3%、及培養基其它條件不變的情況下，30℃發酵144 h，測量各發酵液的纖維素酶活。以空白組的酶活為100%，計算相對酶活。1.2.5 草酸青霉G2產酶條件優化 在單因子實驗基礎上，采用對發酵結果影響較大的藥渣用量、發酵時間、初始pH值、發酵溫度4個因素，進行L9（34）正交實驗（見表1），以濾紙酶活及內切酶活為指標用于優化草酸青霉G2液體發酵條件。

1.2.6 甘草藥渣的酶解研究 參考文獻［14］，利用G2酶、商品酶1（Sigma）、商品酶2（Novozymes）對甘草藥渣進行酶解研究。G2酶組、商品酶1組、商品酶2組中酶的用量為10 U/g（每克甘草藥渣），所有組中固液比1∶50（pH4.8的檸檬酸緩沖鹽），空白組最后加入相同量的緩沖液。在50℃、200 r/min的條件下分別酶解24、48、72 h，取樣測定葡萄糖含量及總黃酮的含量。依據文獻［15］利用葡萄氧化酶法測定葡萄糖量。甘草總黃酮的提取∶料液比1∶20，70%乙醇超聲提取30 min，提取兩次，過濾，合并兩次濾液。參考文獻［16］，測定甘草總黃酮的含量。

表1 草酸青霉G2發酵生產纖維素酶因素水平

2 結果

2.1 甘草藥渣降解菌的篩選及鑒定

2.1.1 菌種初篩 從腐爛的甘草、土壤中篩選得到25株能以甘草藥渣為唯一碳源生長的菌株，其中4株長勢最佳，且在纖維素-剛果紅平板上透明圈較大。同時，經過液體發酵酶活力初步測定（表2），菌株G2最優，故挑選該菌做后續研究。

表2 不同菌種纖維素酶活力的比較

2.1.2 形態學及分子生物學鑒定 將菌株G2接種于PDA培養基上28℃培養3 d，菌落平坦或近于平坦，質地絨狀，菌絲初為白色后逐漸變為暗綠色，分生孢子易脫落，分生孢子結構大量產生，分生孢子面深橄欖綠色，滲出液缺乏，反面近于無色，可溶性色素缺乏。根據以上特征，參照《真菌鑒定手冊》和《中國真菌志》，菌株可初步判定為半知菌綱（Fungi Imperficti）殼霉目（Sphaeropsidales）杯霉科（Discellaceae）青霉屬（Penicillium）。菌株經18S rDNA鑒定為草酸青霉菌（Penicillium oxalicum），命名為草酸青霉菌G2。

圖1 草酸青霉菌G2的18S rDNA進化樹分析

2.2 發酵條件優化

2.2.1 藥渣含量對酶活的影響 利用甘草藥渣作為唯一碳源，考察培養基中不同含量的甘草藥渣對酶活的影響。結果如圖2所示。培養基中甘草藥渣含量為3%時，濾紙酶和內切酶活均為最高。當藥渣含量高于3%時，濾紙酶和內切酶活均開始出現不同程度的降低，尤其是濾紙酶活力降低的較為明顯。

圖2 不同含量藥渣對酶活的影響

2.2.2 初始pH對酶活的影響 圖3為在液態發酵條件下濾紙酶和內切酶活力變化曲線。當培養基的初始pH6-7時，內切酶與濾紙酶活力均較高。當培養基的初始pH3-6時，隨著pH的增加內切酶與濾紙酶活力均逐漸增加；培養基的初始pH大于7時內切酶和濾紙酶活均顯著降低，pH8.0時，內切酶與濾紙酶活均到達最低值。

圖3 初始pH對酶活的影響

2.2.3 發酵溫度對酶活的影響 如圖4所示，發酵溫度20℃時，酶活力最低。發酵溫度30℃時，濾紙酶活和內切酶活均達到最高。當發酵溫度高于30℃時，酶活開始下降，內切酶活下降的較為明顯，但濾紙酶活下降并不明顯。溫度為40℃時，內切酶活和濾紙酶活均高于20℃。

圖4 溫度對酶活的影響

2.2.4 發酵時間對酶活的影響 如圖5所示，隨著發酵時間的延長，酶活力逐漸升高，發酵144 h時，濾紙酶活和內切酶活均達到最大值。發酵時間低于144 h時，隨著發酵時間的增加，濾紙酶活和內切酶活出現不同程度的升高。當發酵時間高于144 h時，此時濾紙酶活和內切酶活開始顯著下降。

圖5 發酵時間對酶活的影響

2.2.5 原材料預處理方式對酶活的影響 以經過不同預處理方式的甘草藥渣為基質配制發酵培養基，其對酶活的影響如圖6。結果表明，預處理組的酶活均低于未處理組。其中NaOH超聲2 h組，產生的酶活最低。在所有預處理組中，濾紙酶活力下降的水平比內切酶更顯著。由于原材料的預處理，導致濾紙酶活力的顯著下降，因此采用不經預處理的甘草藥渣進行發酵。

圖6 原材料預處理方式酶活的影響

2.3 發酵條件的正交優化

在單因子實驗基礎上，采用對發酵結果影響較大的發酵溫度（A）、初始pH值（B）、藥渣含量（C）、發酵時間（D）4個因素，以濾紙酶活及內切酶活為指標，進行L9（34）的正交實驗，用于優化草酸青霉G2液體發酵條件。試驗安排及結果見表3，方差分析見表4。實驗結果顯示，上述4個因素對濾紙酶活與內切酶活的影響一致。由直觀分析可知，4個因素對濾紙酶與內切酶活的影響順序D＞C＞A＞B。表4方差分析結果表明，因素C、D的不同水平對濾紙酶活有顯著影響（P＜0.05，P＜0.05），這與直觀分析的結果一致。因此，最佳發酵工藝條件為A2B2C2D3，即發酵溫度30℃、起始pH6.0、藥渣含量3%、發酵時間144 h。

2.4 正交驗證

通過正交實驗優選出的最佳組合A2B2C2D3，并未出現在正交實驗中。因此需要進行工藝驗證。結果最優組合的濾紙酶活為3.43 U/mL，較正交試驗中的較優組合3.23 U/mL提高了6.2%；內切酶活為16.89 U/mL，高于正交試驗中的較優組合16.07 U/mL，提高了5%。因此，G2的最適發酵條件為：甘草藥渣含量3%、溫度30℃、起始pH6.0、發酵時間144 h。

2.5 甘草藥渣的酶解研究

如表5所示，G2酶對甘草藥渣的降解作用明顯優于商品酶1及商品酶2。在酶解72 h時，G2酶組葡萄糖產量達到最大值121 mg/g，同時總黃酮含量達到68.5 mg/g，與空白組相比總黃酮提取率提高36.2%。酶解72 h時，商品酶1組的葡萄糖產量達到最大值44 mg/g，總黃酮含量達到59.3 mg/g，與空白組相比總黃酮提取率提高17.7%；商品酶2組的葡萄糖產量達到最大值58 mg/g，總黃酮含量達到60.3 mg/g，與空白組相比總黃酮提取率提高了19.6%。

表3 正交實驗結果與分析

表4 方差分析結果

表5 纖維素酶對甘草藥渣的酶解作用

3 討論

篩選性能優良纖維素酶生產菌，是降低纖維素酶生產成本的有效途徑之一［17］。本試驗以腐爛的甘草及土壤為篩選對象。同時，為了避免遺漏優良菌種，除了采用傳統的剛果紅平板法進行初篩外，還以多種纖維素酶活為指標，利用甘草藥渣為底物進行液體發酵復篩。最后從腐爛的甘草中篩選出纖維素降解菌G2，結合形態學以及18S rDNA分析結果確定為草酸青霉。目前，關于草酸青霉的研究較多，不同的研究結果表明，菌株發酵產纖維素酶的性能受培養基組成、原料的品質、菌種數量、操作條件等因素的影響。如李洋等［18］研究發現，碳源、氮源、發酵初始pH對草酸青霉菌株產酶性能有顯著影響。

本試驗考察了藥渣含量、發酵溫度、發酵起始pH、發酵時間以及原材料預處理方式對草酸青霉G2發酵影響。培養基的碳氮比直接影響了發酵效率和微生物的產酶能力［18］。當培養基中藥渣含量發生變化時，其碳氮比也會發生明顯變化，從而導致微生物的產酶效率發生不同程度的變化。發酵起始pH6-7時，G2的產酶性能較高；pH＞7時，G2的產酶性能顯著降低。草酸青霉菌適宜在酸性條件下生長［19］，因此當環境pH呈酸性時利于菌體的生長以及菌株發酵性能的提高。發酵時間低于144 h時，隨著發酵時間的增加，濾紙酶活和內切酶活出現不同程度的升高，這與生物量逐漸增加以及菌體的活力逐漸達到最大值有關。當發酵時間高于144 h時，此時濾紙酶活和內切酶活顯著下降，這可能與發酵液中營養物質的減少以及菌體的活力下降有關。原材料經超聲和NaOH處理均能有效的破壞其木質素的結構，從而暴露纖維素［20-21］。但甘草藥渣經超聲和堿處理以后，酶活卻出現了降低，推測是由于實驗菌株G2分離于腐爛的甘草，G2的生長可能依賴于甘草中的某些成分如：三萜皂苷、黃酮、多糖及蛋白等。本研究雖然應用的是甘草藥渣，對其成分分析結果顯示仍含有一定量的這些成分，但這些成分在預處理過程中會大量損失，如超聲處理可促進這些成分進入溶媒中，堿處理可破壞這些成分，兩者結合會使這些成分的損失更加嚴重，損失越多越不利于菌株G2的生長，從而導致菌株的產酶效率降低，圖6的結果似乎亦支持這一推測。

正交分析結果表明，藥渣含量、發酵時間對菌種的發酵影響較大。同時，還確定了G2的最佳產酶條件：藥渣含量3%、溫度30℃、起始pH6.0、發酵時間144 h。G2利用優化后的工藝進行發酵，濾紙酶活和內切酶活分別達到了3.43 U/mL和16.89 U/mL，濾紙酶活高于此前報道的草酸青霉IODBF-5液體發酵的酶活 2.7 U/mL［22］。

甘草藥渣的酶解結果表明，G2酶對甘草藥渣的酶解效率高于商品酶1、2。李瓊翠等［10］用商品酶酶解甘草藥渣葡萄糖產率僅為29.07 mg/g，低于本試驗的121 mg/g。商品酶在純化的過程中，其成分會出現一定程度上的損失，從而導致其酶活降低［23］。因此，有可能導致商品酶在酶解效率上低于G2生產的粗酶液。已有研究表明，生產纖維素酶的底物與酶解底物為同一原材料時，其生產的纖維素酶對該材料的酶解效率更高［12］。

4 結論

草酸青霉G2液體發酵甘草藥渣可以產生活力較高的纖維素酶，并且該酶能夠有效地糖化甘草藥渣，同時使藥渣中有效成分的提取率得到顯著提高。

［1］Maeda RN, Barcelos CA, Santa Anna LM, et al. Cellulase production by Penicillium funiculosum and its application in the hydrolysis of sugar cane bagasse for second generation ethanol production by fed batch operation［J］. J Biotechnol, 2013, 163（1）：38-44.

［2］Ncube T, Howard RL, Abotsi EK, et al. Jatropha curcas seed cake as substrate for production of xylanase and cellulase by Aspergillus niger FGSCA733 in solid-state fermentation［J］. Industrial Crops& Products, 2012, 37（1）：118-123.

［3］Dhillon GS, Kaur S, Brar SK, et al. Potential of apple pomace as a solid substrate for fungal cellulase and hemicellulase bioproduction through solid-state fermentation［J］. Industrial Crops & Products,2012, 38（3）：6-13.

［4］段金廒, 宿樹蘭, 等. 中藥廢棄物的轉化增效資源化模式及其研究與實踐［J］. 中國中藥雜志, 2013, 38（23）：3991-3996.

［5］敖楊, 等. 金蓮花藥渣發酵物對肉仔雞生產性能、抗氧化指標及免疫功能的影響［J］. 飼料研究, 2014（11）：38-43.

［6］ 黃凡, 譚顯東, 胡偉, 等. 黑曲霉固態發酵三七渣產纖維素酶［J］. 環境工程學報, 2015, 9（9）：4547-4552.

［7］方詩琦. 甘草藥渣中黃酮類活性成分研究［D］. 南京：南京中醫藥大學, 2016.

［8］豆康寧, 王飛, 羅海瀾, 等. 甘草及提取物在食品中的應用進展［J］. 食品研究與開發, 2014（21）：140-142.

［9］白陽, 孫正旺, 劉春瑩, 等. 甘草總黃酮的制備及其抗皮膚老化功能［J］. 大連工業大學學報, 2015（5）：317-319.

［10］李瓊翠, 段曉健, 等. 酸堿復合處理和酶濃度對藥渣纖維素水解效率的影響［J］. 化工進展, 2013（9）：2200-2204.

［11］ 張娟, 卿德剛, 孫宇, 等. 甘草藥渣中甘草查爾酮A的制備［J］. 新疆中醫藥 , 2016, 34（2）：39-40.

［12］ Li Q, Wei TN, Jin CW. Isolation, characterization and application of a cellulose-degrading strain Neurospora crassa S1 from oil palm empty fruit bunch［J］. Microb Cell Fact, 2014, 13（1）：157.

［13］Delabona PS, Farinas CS, Da SM, et al. Use of a new Trichoderma harzianum strain isolated from the Amazon rainforest with pretreated sugar cane bagasse for on-site cellulase production［J］.Bioresour Technol, 2012, 107（2）：517.

［14］Dave BR, Parmar P, Sudhir A, et al. Cellulases production under solid state fermentation using agro waste as a substrate and its application in saccharification by Trametes hirsuta NCIM［J］.Journal of Microbiology Biotechnology & Food Sciences, 2015, 04（3）：203-208.

［15］Zhao XH, Wang W, Tong B, et al. A Newly Isolated Penicillium oxalicum 16 Cellulase with high efficient synergism and high tolerance of Monosaccharide［J］. Appl Biochem Biotechnol,2016, 178（1）：173-183.

［16］Xu MS, Chen S, Wang WQ, et al. Employing bi-functional enzymes for enhanced extraction of bioactives from plants：flavonoids as an example［J］. J Agric Food Chem, 2013, 61（33）：7941-8.

［17］S?rensen A, Teller PJ, et al. Onsite enzyme production during bioethanol production from biomass：screening for suitable fungal strains. ［J］. Appl Biochem Biotechnol, 2011, 164（7）：1058-1070.

［18］李洋, 高曉蓉, 張健, 等. 草酸青霉菌生產纖維素酶的反應條件優化［J］. 生物技術通報, 2016, 32（2）：152-157.

［19］李爭明, 張娟, 等. 纖維素酶產生菌的篩選、鑒定及發酵產酶條件優化［J］. 生物技術通報, 2015, 31（5）：146-152.

［20］ Leite P, Salgado JM, et al. Ultrasounds pretreatment of olive pomace to improve xylanase and cellulase production by solid-state fermentation［J］. Bioresour Technol, 2016, 214：737-746.

［21］Kim JS, Lee YY, Kim TH. A review on alkaline pretreatment technology for bioconversion of lignocellulosic biomass［J］.Bioresour Technol, 2015, 199：42-48.

［22］Saini R, Saini JK, Adsul M, et al. Enhanced cellulase production by Penicillium oxalicum for bio-ethanol application. ［J］. Bioresour Technol, 2015, 188：240-246.

［23］Lin C, Shen Z, Qin WS. Characterization of xylanase and cellulase produced by a newly isolated Aspergillus fumigatus, N2 and its efficient saccharification of barley straw［J］. Applied Biochemistry & Biotechnology, 2017, 182（2）：559-569.

Screening the Strains Degrading Glycyrrhiz uralensis Residues and Its Enzyme Production

ZENG Fei1ZHANG Sen1QIAN Da-wei1ZHU Zheng-hua1ZHOU Jia-lin2DUAN Jin-ao1
（1. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization，National and Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Traditional Chinese Medicine Resource Recycling，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023 ；2. Tianjiang Pharmaceutical Industry of Jiangsu Province，Jiangyin 214400）

This work aims to screen the strains that can degrade Glycyrrhiza uralensis residues（GUR）and to optimize the production process of cellulase by the strains. First，the strains were screened from decayed Glycyrrhiza uralensis and soil，and then were identified through morphological observation and 18S rDNA. Second，the effects of different factors on the fermentation of the isolated strains were studied，and the orthogonal test L9（34）was used to determine the optimal condition of producing enzyme. The produced cellulase complex was used to investigate how the enzymatic hydrolysis of GUR was proceeding. According to the results，the isolated strain was identified as Penicillium oxalicum，designated as G2. The effects of concentrations of herb residues and fermentation time on cellulase production of G2 were significant（P＜0.05 and P＜0.05）. Under the optimal conditions，the FPase activity reached 3.43 U/mL and EG activity reached 16.89 U/mL. Compared with commercial cellulase，the cellulase by G2 was more efficient in degrading GUR. In addition，the extraction rate of total flavonoids from Glycyrrhiza uralensis Fisch was significantly higher after enzymatic hydrolysis. Here screening the GUR-degrading bacteria and studying the process of producing the enzyme from the GUR laid the foundation for the rational utilization of GUR and the production of cellulase with low cost and fine performance.

Glycyrrhiza uralensis residues；cellulase；Penicillium oxalicum

2017-02-22

江蘇省自然科學基金項目（BK20161048），江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心第三批重點項目（ZDXM-3-17），江蘇省產學研前瞻性聯合研究項目（BY2015008-04）

曾飛，男，碩士研究生，研究方向：中藥資源化學；E-mail：zoucungao@sina.com

段金廒，教授，研究方向：中藥資源化學；E-mail：dja@njucm.edu.cn

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0419

（責任編輯 李楠）