長鏈非編碼RNA AK043773在脂肪細胞分化中的作用

張娟娟 喬玲 朱恩東

（天津醫科大學代謝病醫院內分泌研究所 衛生部激素與發育重點實驗室 天津市代謝性疾病重點實驗室，天津 300070）

長鏈非編碼RNA AK043773在脂肪細胞分化中的作用

張娟娟 喬玲 朱恩東

（天津醫科大學代謝病醫院內分泌研究所 衛生部激素與發育重點實驗室 天津市代謝性疾病重點實驗室，天津 300070）

探索長鏈非編碼RNA（lncRNA）AK043773在脂肪細胞分化過程中的表達變化和調控作用。將小鼠前脂肪細胞成脂誘導，利用實時定量PCR技術檢測成脂分化調控基因KLF7及AK043773的表達，構建AK043773過表達載體檢測其對成脂分化的影響。經UCSC數據庫檢索發現AK043773位于KLF7基因4號外顯子的3'端下游，骨髓基質細胞系ST2和前脂肪細胞系3T3-L1成脂誘導分化后，實時定量PCR檢測結果顯示AK043773及KLF7表達協同下調；構建pCDNA3.1-AK043773過表達載體，轉染ST2細胞后能顯著提高AK043773的表達，進行脂肪細胞分化條件誘導，通過油紅O染色及OD520nm吸光值檢測可見AK043773過表達顯著抑制ST2細胞中脂滴產生。AK043773及KLF7在脂肪細胞分化過程中協同下調，上調AK043773的表達可顯著抑制脂肪細胞分化。

長鏈非編碼RNA；AK043773；脂肪細胞分化；KLF7

肥胖的發病率在我國日益上升，2013年針對我國大于20歲的成年人進行統計，肥胖發病率為8.8%，超重人群則達到55.7%［1］。肥胖的發生是脂肪異常堆積的結果，對脂肪細胞分化機制的深入研究有益于為肥胖的治療提供有效策略［2］。脂肪細胞的分化過程是多條信號通路以及大量轉錄因子協同級聯調控的結果［3］。近期研究發現kruppel樣鋅指轉錄因子家族（Kruppel-like factor，KLF）成員廣泛參與脂肪細胞分化［4］。在人前脂肪細胞和小鼠3T3-L1細胞中過表達KLF7可以顯著抑制脂滴產生，并顯著抑制脂肪細胞特異性基因PPARγ、C/EBPα、aP2和adipsin的表達［5］。此外，有研究顯示長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）也參與脂肪細胞分化過程的調控［6］。lncRNA是一類片段長度大于200 bp的內源性RNA分子，人類基因組中只有大約1%具有蛋白編碼潛能，然而在特定的發育節點卻有大約70%的基因組轉錄，其中多數轉錄本屬于lncRNA，它們通常由RNA聚合酶II轉錄，經RNA剪接過程成熟，具有譜系特異性并行使多種生物學功能。例如，胞核lncRNA參與形成核糖核蛋白復合體從而修飾染色體結構影響基因轉錄活性，胞漿lncRNA可以直接或通過吸附microRNA調控mRNA 的穩定［7-9］。Sun等［10］通過比對原代棕色和白色脂肪細胞、前體脂肪細胞以及成熟脂肪細胞的轉錄組，發現脂肪細胞分化過程中，175個lncRNAs被特異調控，而且C/EBPα和PPARγ可以結合于大量lncRNA的啟動子區域，通過RNAi抑制其中10個lncRNAs可以顯著抑制脂滴形成。

本研究擬通過分析lncRNA AK043773的基因定位，鑒定其在脂肪細胞分化過程中的表達和功能，旨在為進一步探索lncRNA AK043773在脂肪細胞分化中的分子作用機制奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠骨髓基質細胞ST2、前脂肪細胞3T3-L1和質粒pCDNA3.1（+）由本實驗室保存；SPF級雄性6周齡C57BL/6小鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司；Trans5α感受態細胞、TransStart FastPfu DNA Polymerase和T4 DNA 連接酶購自北京全式金生物技術有限公司；BamH I和EcoRⅤ內切酶購自美國Thermo Fisher；質粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒購自北京天根生化科技公司；Lipofectamine 2000 購 自 美 國 Invitrogen；α-MEM 和 DMEM/H 培養基購自美國Hyclone；胎牛血清FBS購自德國SeraPro；RNA提取試劑E.Z.N.A. Total RNA Kit購自美國Omega Bio-tek；Reverse Transcription Kit 購自美國 Thermo Fisher；SGExcel Fast SYBR Mixture kits及特異性引物購自生工生物工程有限公司；誘導試劑胰島素（Insulin）、地塞米松（Dex）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）和油紅O購自美國Sigma；吲哚美辛（Indo）購自美國Cyagen Biosciences Inc。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養與成脂分化誘導 小鼠骨髓基質細胞ST2用含10% FBS的α-MEM培養基，前脂肪細胞3T3-L1用含10% FBS的DMEM/H培養基，置于37℃、5% CO2培養箱內培養，待細胞長至80%以上時傳代。將細胞接種于12孔板，細胞密度達90%以上時進行成脂分化誘導。成脂誘導分化利用經典的激素雞尾酒法，誘導試劑包含0.05 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、5 mg/L 胰島素、0.05 mmol/L吲哚美辛和0.05 μmol/L地塞米松。

1.2.2 pCDNA3.1- AK043773載體的構建 設計合成擴增AK043773片段的特異性引物，以C57BL/6小鼠肝臟DNA為模板，經FastPfu DNA聚合酶擴增獲得AK043773片段全長，將克隆片段與pCDNA3.1（+）載體分別進行BamH I和EcoRⅤ內切酶雙酶切，膠回收PCR片段及載體大片段后用T4 DNA 連接酶連接，連接產物轉化至大腸桿菌Trans5α感受態細胞，提取單克隆后雙酶切鑒定，鑒定正確克隆送交Invitrogen測序，測序正確載體命名為pCDNA3.1-AK043773載體。載體引物上游：5'-GCG GAT CCG AGA GGG CTG GAC TTC AG-3'，下游5'-CCG GAT ATC CTT TTT TTA TAG AGC CTT GCA TTG G-3'。下劃線代表酶切位點，其中GGATCC為BamH I，GATATC為EcoRⅤ。

1.2.3 pCDNA3.1及pCDNA3.1- AK043773載體轉染 轉染前1 d，將ST2細胞接種于12孔板，轉染當天細胞融合度達70%-90%時進行轉染。轉染試劑采用Lipofectamine 2000，轉染6 h后細胞換液，具體實驗步驟依說明書為準。轉染24 h后可進行成脂細胞分化誘導；轉染48 h后可檢測轉染效率。

1.2.4 RT-qPCR檢測KLF7和lncRNA AK043773的表達水平 ST2和3T3-L1細胞誘導成脂分化3 d后收取細胞，pCDNA3.1及pCDNA3.1- AK043773載體轉染ST2細胞48 h后收取細胞，按照E.Z.N.A. Total RNA Kit說明書分別提取各組細胞總RNA，利用Reverse Transcription Kit將 0.5 μg總 RNA 逆轉錄為cDNA。逆轉錄的條件：25℃ 10 min；42℃ 60 min；70℃ 10 min。

逆轉錄合成的cDNA作為模板，qPCR檢測KLF7和lncRNA AK043773的表達。根據SGExcel Fast SYBR Mixture kits試劑盒說明書加入qPCR所需的2×Mix、cDNA和特異性引物反應。反應體系為20 μL，內參為β-actin。反應條件為：95℃預變性2 min；95℃變性30 s、57℃退火15 s、72℃延伸15 s，40個循環。PCR產物采用溶解曲線法分析，以確定樣品擴增的特異性。采用2-ΔΔCt法計算目的基因實驗組與對照組的表達差異，Ct值指反應管中熒光信號達到一定閾值時所經歷的循環數。所有實驗重復3次。KLF7 qPCR引物上游5'-ACT GAC AAA CAA ACA GAC CCA G-3'，下游 5'-GGT AGC GTT CCA ACT CAA GG-3'；lncRNA AK043773 qPCR引物上游5'-ACG CCA GGG ATG GCA TTA-3'，下游5'-GAG CCT TGC ATT GGT CAG T-3'；β-actin qPCR引物上游5'-AAG ACC TCT ATG CCA ACA CAG-3'，下游5'-GGA GGA GCA ATG ATC TTG ATC-3'。

1.2.5 油紅O染色及OD值檢測 pCDNA3.1及pCDNA3.1- AK043773載體轉染ST2細胞24 h后，進行成脂細胞分化誘導，待脂滴成熟后棄細胞培養基，1×PBS洗2次；4%多聚甲醛固定15 min后棄液，1×PBS洗1次；加入60%異丙醇，室溫放置1-2 min后棄液；加入60%油紅O染液，染色5 min，蒸餾水漂洗2次，于倒置顯微鏡下觀察并拍照。拍照后棄水，將細胞培養板倒置晾干后，每孔加400 μL異丙醇萃取油紅O，常溫放置20 min，移至96孔板檢測吸光度，波長設置520 nm。

1.2.6 統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行統計處理。實驗數據以均數±標準差（x-±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA AK043773的基因位點分析

經UCSC數據庫（http://genome.ucsc.edu/）檢索，lncRNA AK043773基因全長2 720 bp，位于KLF7基因4號外顯子的下游（圖1）。

圖1 lncRNA AK043773的基因位點分析

2.2 lncRNA AK043773的蛋白編碼能力分析

為確定AK043773的編碼能力，經蛋白編碼能力預測數據庫CPAT：Coding-Potential Assessment Tool（http://lilab.research.bcm.edu/cpat/index.php）分析，AK043773的蛋白編碼能力得分為0.13，作為對照，KLF7基因（NCBI序列參考編號為 NM_033563.2）的蛋白編碼能力得分為0.98。由此可見，AK043773編碼蛋白的潛能極低，屬于非編碼RNA（圖2）。

圖2 lncRNA AK043773的蛋白編碼能力分析

2.3 RT-qPCR檢測3T3-L1和ST2細胞成脂誘導后KLF7和lncRNA AK043773的表達

ST2和3T3-L1細胞通過經典的激素雞尾酒法成脂誘導分化3 d后，與未成脂分化細胞分別提取總RNA，逆轉錄后進行RT-qPCR檢測。結果（圖3）顯示，與未成脂分化的細胞相比，在成脂分化的3T3-L1和ST2細胞中，KLF7分別顯著下降至0.80和0.47，lncRNA AK043773分別顯著下降至0.74和0.49。

圖3 KLF7和lncRNA AK043773在3T3-L1和ST2細胞成脂前后的表達水平

2.4 成功構建pCDNA3.1-AK043773表達載體

以雄性C57BL/6小鼠肝臟DNA為模板，通過PCR特異性擴增2 720 bp的AK043773基因全長，通過BamH I和EcoR Ⅴ雙酶切位點克隆至pCDNA3.1（+）載體，命名為pCDNA3.1- AK043773。測序結果正確，PCR特異性擴增片段與pCDNA3.1- AK043773載體雙酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳，結果均顯示載體構建成功，擴增片段及酶切結果見圖4。

2.5 RT-qPCR檢測pCDNA3.1-AK043773轉染ST2細胞后lncRNA AK043773的表達

圖4 AK043773基因PCR特異性擴增、pCDNA3.1-AK043773載體PCR特異性擴增及其雙酶切鑒定

pCDNA3.1及pCDNA3.1- AK043773載 體 分別轉染ST2細胞48 h后收取細胞，分別提取總RNA，逆轉錄后進行RT-qPCR檢測。結果（圖5）顯示，與pCDNA3.1載體轉染組相比，轉染pCDNA-3.1-AK043773載體可以顯著提高ST2細胞中lncRNA AK043773的表達水平至13.06倍。

圖5 pCDNA3.1及pCDNA3.1-AK043773載體轉染ST2細胞后lncRNA AK043773的表達

2.6 lncRNA AK043773對脂肪細胞分化的影響

pCDNA3.1及pCDNA3.1- AK043773載體分別轉染ST2細胞后誘導成脂分化，待脂滴成熟后進行油紅O染色，pCDNA3.1- AK043773載體轉染組較pCDNA3.1載體轉染組細胞脂滴明顯減少；異丙醇萃取油紅O后經OD520nm波長吸光值檢測，可見pCDNA3.1- AK043773載體轉染組較pCDNA3.1載體轉染組下降30%（圖6）。

3 討論

肥胖被定義為體脂超標，肥胖患病率的持續上升使得脂肪組織及脂肪細胞生成被廣泛關注［11］。脂肪組織是非?；钴S重要的內分泌器官，對能量及代謝穩態的維持至關重要［12］。脂肪細胞是脂肪組織的主要組成部分，脂肪細胞主要由成纖維樣前脂肪細胞分化發育而來，脂肪細胞的分化是多種轉錄因子級聯反應及各種調控因子調節的結果［13-15］。近期有研究顯示lncRNA廣泛參與生命活動的發育和分化進程［16-18］。2013年，Sun等［10］首次針對體外培養的小鼠的前白色、棕色脂肪細胞以及分化成熟的白色、棕色脂肪細胞，篩選得到polyA尾轉錄譜然后進行RNA測序，鑒定了175個差異表達的lncRNA，其中很多脂肪細胞富集的lncRNA啟動子區有PPARγ和C/EBPα的結合位點，用RNAi抑制這些lncRNA的表達可以有效抑制成脂。2014年，Cooper等［19］在小鼠3T3-L1細胞中發現lncRNA NEAT1可以與SRp40通過調控PPARγ2的剪接影響成脂。2016年，Huang等［20］發現lncRNA H19可以通過組蛋白去乙酰化酶的表觀修飾抑制骨髓來源間充質干細胞的成脂分化。這些研究結果提示lncRNA也參與了脂肪細胞的分化生成階段。

圖6 lncRNA AK043773對脂肪細胞分化的影響

在研究前期，對原代培養的小鼠骨髓基質細胞進行脂肪細胞誘導分化，72 h后采用芯片技術獲得脂肪細胞分化前后的lncRNA及mRNA表達譜。發現在成脂分化的細胞中KLF7表達顯著下調，該結果與文獻報道一致［5］，而位于KLF7基因4號外顯子下游的lncRNA AK043773協同下調。經蛋白編碼能力預測數據庫Coding Potential Calculator（http://cpc.cbi.pku.edu.cn/programs/run_cpc.jsp） 分 析，lncRNA AK043773不具備編碼蛋白的潛能。通過RT-qPCR驗證了芯片結果，從而提示lncRNA AK043773可能參與脂肪細胞分化的調控，而且其可能發揮負向調控的功能。通過構建lncRNA AK043773的過表達載體并轉染ST2細胞，經成脂誘導后證明了我們的猜想，即過表達lncRNA AK043773可以抑制脂肪細胞分化。

后續研究將驗證lncRNA AK043773的蛋白編碼潛能，通過5'和3'cDNA末端快速克?。≧ACE）實驗確定其全長，通過分離脂肪分化前后細胞的胞核和胞漿部分，采用RT-qPCR技術確定lncRNA AK043773的亞細胞定位，通過設計合成lncRNA AK043773的siRNA驗證其在脂肪細胞分化中的功能。本研究發現lncRNA AK043773位于KLF7基因的下游，后續研究還將探討其是否通過順式作用影響KLF7的表達發揮其抑制脂肪細胞分化的功能，從而進一步深入的研究lncRNA AK043773發揮調控功能的分子機制，為闡釋脂肪細胞分化進程的調控提供新理論。

4 結論

本研究發現了一個新的lncRNA AK043773，其位于KLF7基因4號外顯子的下游，在成脂分化的ST2和3T3-L1細胞中表達下調，在ST2細胞中過表達lncRNA AK043773可以抑制脂肪細胞分化。

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Role of Long Non-coding RNA AK043773 in Adipocyte Differentiation

ZHANG Juan-juan QIAO Ling ZHU En-dong
（Key Laboratory of Hormones and Development（Ministry of Health），Tianjin Key Laboratory of Metabolic Diseases，Metabolic Diseases Hospital & Institute of Endocrinology，Tianjin Medical University，Tianjin 300070）

This work is to investigate the expression changes and regulating role of long non-coding RNA（lncRNA）AK043773 in adipocyte differentiation. First，pre-adipocyte cells in mice were induced for adipogenesis. Then，the expressions of adipogenic differentiation regulating gene（KLF7）and AK043773 were measured by real-time quantitative PCR（RT-qPCR）. Next，the overexpression vector for AK043773 was constructed for detecting its effects on adipogenic differentiation. According to search in UCSC database，the locus of AK043773 was in the 3'-end downstream of KLF7’s exon 4. The expressions of KLF7 and AK043773 were down-regulated coordinately in adipogenesis-induced and differentiated bone marrow stromal cell line ST2 and pre-adipocyte cells 3T3-L1. Furthermore，the overexpression vector pCDNA3.1-AK043773 was constructed and transfected into ST2 cells，which significantly enhanced the expression of AK043773，but inhibited the adipogenesis in ST2 cells by oil red O staining and OD520nmabsorbance test after the induction of adipocyte differentiation. All of results indicate that AK043773 and KLF7 coordinately down-regulate in adipocyte differentiation，and increasing the expression of AK043773 remarkably suppresses the differentiation of adipocyte.

lncRNA；AK043773；adipocyte differentiation；KLF7

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0556

2017-07-04

國家自然科學基金項目（81501846），天津醫科大學代謝病醫院內分泌研究所科學基金（2014RC01）

張娟娟，碩士研究生，研究方向：脂肪與成骨細胞分化調控研究；E-mail：839973071@qq.com

朱恩東，助理研究員，研究方向：脂肪與成骨細胞分化調控研究；E-mail：ezhu@tmu.edu.cn

（責任編輯 朱琳峰）