高通量基因型分型技術及其在水稻中的應用

張先文 賀治洲 江南 鄧華鳳 李繼明

（1. 雜交水稻國家重點實驗室 湖南雜交水稻研究中心 湖南省農業科學院，長沙 410125；2. 華智水稻生物技術有限公司，長沙 410125；3.湖南農 業大學生物科學技術學院，長沙 410128）

高通量基因型分型技術及其在水稻中的應用

張先文1，2，3賀治洲2江南2鄧華鳳1李繼明2

（1. 雜交水稻國家重點實驗室 湖南雜交水稻研究中心 湖南省農業科學院，長沙 410125；2. 華智水稻生物技術有限公司，長沙 410125；3.湖南農 業大學生物科學技術學院，長沙 410128）

作物種質資源遺傳基礎的深入認識與高效利用，對于品種改良和糧食安全具有重要意義。傳統系譜考察的方法對指導育種實踐發揮了重要作用，隨著分子生物學的發展，基因組學和高通量SNP分子標記等基因型分型方法可以更便捷地對種質資源進行鑒定。就基因型分型的主要方法進行了總結，重點論述了以SNP為核心的下一代高通量測序（NGS）分型方法、競爭性等位基因特異性PCR（KASP）和SNP芯片系統，以及當前主流的SNP分析工具和數據庫。同時，介紹了高通量SNP分型技術在水稻研究中的進展，并就分型技術在作物育種等領域的應用和發展趨勢進行了展望。

系譜；SNP；分型；下一代高通量測序；競爭性等位基因特異性PCR

對野生動植物的馴化和利用極大地推動了人類社會文明的進步，對植物種質資源遺傳背景和多樣性的認識與利用加速了植物育種技術的革命，從而為人類提供更多更優質的糧食和其他植物類產品。隨著人口的增加、環境的惡化以及社會的發展，未來的糧食需求對包括水稻、麥類和玉米等主要糧食作物的育種提出了更高的要求，不僅要求穩產、高產，還要優質。在這種背景下，對優良種質資源的挖掘、培育和高效利用就成為現代育種的重要目標。因此，了解種質資源的進化、遺傳背景和親緣關系就成為雜種優勢利用和品種改良的重要基礎［1，2］。

早期育種過程中對親本遺傳背景和親緣關系的分析主要基于對其系譜和性狀的考察，通過取長補短，優勢互補，在雜交后代中篩選符合預期的表型性狀，經過連續多代的選擇以獲得穩定的純合系。我國育種學家開展了大量基于資料歸納和親本調查的系譜分析工作［3-4］，對促進我國主要作物的育種工作發揮了重要作用。

隨著分子生物學技術的快速發展，對主要作物基因組的認識也日益全面和深入，人們開發了包括限制性片段長度多態性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）、多態性DNA隨機擴增（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）、擴增片段長度多態性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）、微衛星 DNA（Simple sequence repeats，SSR）和單核苷酸多態性（Single nucleotide polymorphism，SNP）等在內的多種DNA水平的分子標記，并由此建立了多種基因型分型的方法，在指紋圖譜構建、遺傳多樣性分析、種質資源鑒定和新等位基因的挖掘等方面得到了廣泛應用［5，6］。尤其是下一代高通量測序（Next generation sequencing，NGS）［7］和SNP分型技術［8］的發展，極大促進了對種質資源和重要性狀相關等位基因的挖掘與鑒定，對提高育種過程中親本選擇與利用以及目標表型的篩選效率具有重要意義。

1 基因型分型的主要方法

1.1 傳統的基因型分型方法

傳統的基因型分型方法主要基于早期開發的DNA水平的分子標記，如第一代以Southern雜交為基礎發展起來的RFLP分子標記和第二代以PCR為基礎發展起來的RAPD、AFLP和SSR等分子標記［9］。由于這些DNA分子標記具有與特定農藝和經濟性狀緊密連鎖的特點，已被廣泛應用于挖掘和克隆與特定農藝和經濟性狀相關的位點和基因組區段，使之在目標基因定位、標記輔助育種和基于圖位克隆策略克隆新基因等研究中發揮著重要作用［10］。在這些分子標記中，SSR標記最早被用于植物育種。并且，隨著分子生物學的發展和分子標記的開發利用，SSR等分子標記也被廣泛應用于親緣關系、遺傳距離和遺傳多樣性分析等。但由于第一代RFLP分子標記的檢測成本高和實驗操作繁瑣等特點而影響了其在實際使用中的推廣。第二代分子標記中的RAPD標記技術的可靠性較差，AFLP標記則由于其技術的專利保護及操作程序長、步驟多、并要求很高的實驗技能和精密的儀器設備等缺點，而難以被普及使用［9］。而且由于第一代和包括SSR等在內的第二代分子標記大多是在非編碼區擴增或是在基因組中隨機擴增，因此獲得的多態性位點通常與目標性狀基因的遺傳距離較遠，這就限制了這些標記在重要農藝性狀基因的定位、圖位克隆以及分子標記輔助育種中的應用［11］。隨著高通量測序技術的廣泛應用［7］，推動了標記技術的發展，使得SNP等第三代分子標記逐漸居于主流地位［8］。

1.2 高通量的基因型分型方法

近年來，隨著群體遺傳學和NGS技術的發展，越來越多的植物品種和品系的基因組重測序使SNP標記日益豐富，以其共顯性、數量多、分布廣和易于實現自動化分析等特點得到了日益廣泛的研究和應用。為了進一步提高已有SNP的使用效率和分析通量，人們建立了競爭性等位基因特異性PCR［12］（Competitive allele-specific PCR，KASP）技術和SNP芯片技術平臺［13］，促進了以SNP為核心的高通量基因型分型技術的發展，從而極大地推動了水稻、玉米、小麥等作物在遺傳、種質鑒定和功能基因的克隆與鑒定、分子育種等方面的研究。

1.2.1 高通量測序技術 利用NGS對作物種質資源的廣泛重測序所獲得的基因組數據，有助于深入挖掘SNP標記，從而全面分析不同品種之間的遺傳差異，為在全基因組水平了解物種的進化、親緣關系以及挖掘功能相關標記和基因提供了重要工具。深圳華大基因研究院較早開展了基于水稻高通量測序數據的SNP分析工作［14］。Yamamoto等［15］對水稻日本晴的近緣種越光進行了全基因組測序，并利用1 917個SNP位點對151個代表性的日本水稻材料進行了基因型分析。結果表明，60.9%的越光基因組具有原始祖先的單倍型，還發現現代育種技術降低了水稻的遺傳多樣性。Xu等［16］利用對40個栽培稻和10個野生稻的重測序數據，獲得了650萬個高質量的SNP位點，并在栽培稻中鑒定了大量低多樣性的基因，可能位于馴化過程中受到人工選擇的候選區域。

1.2.2 基于競爭性等位基因特異性PCR（KASP）的高通量SNP分型 熒光染料EvaGreen等因為能以飽和的方式結合到雙鏈DNA分子上，而且價格便宜，從而被廣泛應用于實時定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）［17］。隨后，利用該熒光報告系統開發出了可以高通量檢測SNP和InDel（Insertion-deletion）分子標記的 KASP技術［12］。其原理是利用兩條3’-末端堿基不同的等位基因正向引物分別對應檢測位點的不同堿基狀態，帶有不同熒光的兩條檢測引物可以分別檢測兩條正向引物5’端的互補序列，經過與同一條反向引物PCR擴增以后，待測位點的多態性即可通過不同的熒光信號得以檢測出來。該技術適用于高通量分析平臺，可同時對大批量的SNP標記和樣品進行精準的雙等位基因驗證和檢測［18-19］。由于其通量高、穩定性好和價格便宜等優點，該技術已廣泛應用于人、動物和植物遺傳學研究與群體分型［20］。目前，英國LGC公司開發了最先進的基于KASP技術的SNPline分析平臺。國內已有包括中國農業科學院、中國農業大學、中種集團和華智水稻生物技術有限公司等多家單位引進了這套系統。

1.2.3 基于SNP芯片的分型技術 由于NGS的發展和成本的下降，更多物種資源被測序和重測序，這為高質量全基因組水平SNP的挖掘提供了便利，使得開發SNP芯片用于SNP的高通量檢測成為一種趨勢［13］，并獲得快速發展（表1）。SNP芯片的工藝原理是在玻璃基片上通過光蝕刻的方式形成微米級的小孔，用以容納微珠，每個微珠偶聯上幾十萬個具有相同序列的DNA片段，該DNA片段游離的3’-端約50 bp的序列可與特定的SNP或InDel位點結合，芯片經過與待測樣品的基因組DNA雜交以后檢測雜交信號，即可在全基因組水平快速分析材料的遺傳背景［21］。較早的全基因組SNP芯片開發是在櫻桃上進行的［22］。隨后，多個針對蘋果、小麥和玉米等物種的芯片系統被陸續開發并廣泛應用［23-26］。

在水稻高通量檢測和分型方面，鄧興旺［27］課題組曾指出基于組學如NGS和芯片技術的基因型分型平臺的發展和應用將在分子設計育種實踐中發揮重要作用。隨后，人們又開發了多款水稻全基因組SNP芯片［28-30］。最近，華智水稻生物技術有限公司聯合中國農業科學院開發了一款整合了56 897個SNP標記的56 K SNP芯片（未發表的數據），該芯片基于全球3 024份水稻樣本的重測序數據［31］。

表1 商業化的SNP芯片

1.3 SNP分析工具和數據庫

隨著越來越多作物品種被測序，SNP標記也日益豐富，為方便SNP數據的高效管理和有效利用，人們開始SNP分析工具和數據庫的開發與研究（表2）。較早期的AutoSNPdb數據庫主要基于EST數據而開發，它包含了水稻、大麥和花椰菜等的SNP數據［32］。隨后，一批通用性好、具有交互功能的SNP分析工具陸續得到了開發和應用［33-35］。近年來比較重要的水稻SNP分析平臺主要有HapRice［36］、RiceVarMap［37］和 IC4R［38］。HapRice 主要提供 SNP信息和檢索功能。RiceVarMap提供基于標記名稱、基因組區域、基因名稱和基因注釋等方式的標記查詢。IC4R整合了來源于多個平臺的水稻表達譜數據、同源檢索數據庫、水稻遺傳多樣性數據庫和水稻相關文獻挖掘等。CerealsDB是一款針對小麥（Triticum aestivum）SNP標記鑒定和分型的數據庫［39］。

表2 SNP分析工具和數據庫

2 高通量基因型分型技術在水稻中的應用

水稻作為我國最重要的糧食作物，對保障國家糧食安全具有不可替代的重要性。在新形勢下，保障水稻高產、穩產和優質就成為水稻育種刻不容緩的目標。為此，近年來，人們利用NGS和水稻全基因組SNP芯片等高通量基因型分型技術結合全基因組關聯分析（Genome-wide association study，GWAS），在水稻種質資源進化、重要農藝性狀、抗病和耐逆相關位點的挖掘與鑒定方面取得了長足進展，極大促進了水稻功能基因組學的發展，為水稻育種提供了重要的參考信息。

2.1 水稻進化與人工選擇研究

在水稻人工選擇和馴化方面，He等［40］對來自秈稻、粳稻和野生稻的66個水稻材料進行了重測序。結果顯示，秈稻和粳稻有獨立的起源祖先，且許多低多樣性區域（LDRs）僅僅包含有一個已知的馴化基因，并鑒定出13個新的馴化相關基因。Lestari等［41］克隆了43個水稻品種的254條編碼蔗糖合成酶3（RSUS3）的序列，通過SNP和InDel標記的分析最終鑒定了11個單倍型，發現了至少11個重組事件，且主要發生在轉錄區，為今后的遺傳相關性研究建立了一種新的分類學方法。Yonemaru等［42］對177個日本水稻品種的遺傳背景分析顯示，由于育種選擇導致在多個染色體區段的單倍型多樣性下降，同時還發現由于人工選擇而出現了新的單倍型多樣性。這為通過基因聚合和人工選擇來形成新的單倍型提供了理論基礎。人們通常認為，現代野生稻是野生稻祖先群體的后代，野生稻的祖先群體衍生出現代馴化水稻。基于對203個馴化水稻和435個亞洲野生稻重測序數據的最新研究結果，Wang等［43］發現現代野生稻是一個雜合群體，這與野生稻和馴化水稻之間持續而廣泛的通過花粉或種子介導的基因漂移有關。

2.2 水稻重要農藝性狀相關位點分析

近年來，利用GWAS策略挖掘水稻重要農藝性狀的相關位點取得了重要進展。基于533份地方品種和雜交水稻的SNP標記，Yang等［44］進行了15個性狀的GWAS分析，鑒定了一批與谷粒緊實度、谷粒投射面積等性狀相關的SNP位點。對來自73個國家和地區的1 479個水稻品種的GWAS分析發現，大量與株高、葉夾角、開花時間、每株分蘗數、每穗粒數、粒重等性狀相關的基因和位點在育種過程中受到了強烈選擇［45］。Biscarini等［46］利用57 000個SNP標記對391個溫帶粳稻品種進行了GWAS分析，最終檢測到42個基因型與表型之間的顯著關聯，其中控制劍葉寬度和株高的最顯著關聯分別位于4號和6號染色體。這些強關聯的發現將可能應用于水稻的人工選擇。最近，中科院植物生理生態研究所韓斌［47］課題組在雜種優勢機理研究方面取得了重要進展。他們對17個代表性雜交水稻的F2代群體進行了重測序，獲得了170萬個SNP。隨后的GWAS分析顯示，盡管沒有找到在所有材料中都存在的雜種優勢相關位點，但在每個組內，有一些來自母本的基因組位點具有比父本更強的優勢，同時還發現了產量相關的雜合位點和超親雜種優勢具有部分顯性特征的證據。水稻早期生長勢與積累、儲藏和利用非結構性糖從而產生更大或更多葉片的基因型有關。Rebolledo等［48］利用12 221個SNP對123個日本水稻品種的早期生長勢進行了GWAS分析，發現了9個與株高、營養器官的細胞大小或數目等相關的關聯。

2.3 水稻耐逆和抗病相關研究

挖掘對脅迫耐受的水稻相關基因和資源是目前水稻功能基因組學研究和育種的重要任務。Kumar等［49］利用SNP芯片對220個水稻品種的12個性狀進行了GWAS分析，最終鑒定了20個與Na+/K+比值高度相關的SNP位點。Rahman等［50］利用376個SNP標記從107份水稻中最終鑒定出一批與已知耐鹽品種不同的耐鹽水稻資源。水稻對稻瘟病（Magnaporthe oryzae）的抗性是由許多主效基因或數量性狀位點（Quantitative trait locus，QTL）來決定的。為了在全基因組水平探究水稻抗稻瘟病的分子機制，Kang等［51］利用水稻44K全基因組SNP芯片對420份水稻品種進行了稻瘟病抗性的GWAS分析，并利用含7萬個SNP標記的芯片進行了驗證，最終鑒定了97個稻瘟病抗性相關位點（LABRs）。其中82個為新位點，15個位點與已知抗性位點在同一區域。在LABRs區域的所有候選基因中，LABR_64與水稻對5個稻瘟病菌的抗性顯著相關。

3 結語

通過系譜法了解作物品種的遺傳基礎，追溯親本來源，對于縮短作物育種進程，提高育種效率，充分利用雜種優勢，具有重要意義。隨著分子生物學的發展和基因組學與高通量分子標記技術的興起，人們對作物遺傳背景的分析有了更便捷的工具，如基于重測序數據的基因型分型方法（Genotyping-based Squencing，GBS）［7］和 基 于 KASP［18-19］和 SNP 芯片［13］的高通量SNP分析技術，對育種群體目標性狀的篩選和鑒定也有了更高效而科學的手段，而不再只依賴人工的田間性狀觀察和分析。但是重測序、KASP和SNP芯片的測試和數據分析成本比較高，而且對儀器設備和實驗員的專業技術水平均有較高的要求，因此，此類實驗需要有較大的項目支持，而且一般都由專業公司來完成。目前，國內已有多家公司和單位可以承擔重測序和SNP高通量測試和分析任務，如華大科技的Illumina SNP芯片分型平臺和Affymetrix基因分型平臺，華智和中玉金標記的高通量分子育種平臺，北京百邁克和上海歐易的全基因組重測序分析平臺等。這些高通量分型技術的應用和專業技術平臺的建立極大地推動了國內分子標記輔助選擇［52］和基因組選擇（Genomic selection，GS）［53］在動植物育種方面的應用，提升了種質資源多樣性的利用水平，提高了育種效率。

同時，由于作物很多重要的經濟和農藝性狀往往受多基因或多位點影響，因此通過單個或者多個SNP對性狀進行研究并不能取得理想的效果。而在進化和選擇過程中有可能出現由多個功能相關SNP緊密連鎖形成的單倍型，由于單倍型含有更多的連鎖不平衡（Linkage disequilibrium，LD）信息可以挖掘，更有利于在關聯分析（GWAS）中尋找和定位性狀相關基因位點。利用GBS和高通量SNP分析技術，可以在全基因組水平獲得自然群體進化、遺傳多樣性和單倍型等信息。因此，在全基因組水平上的基因型分型和單倍型分析與挖掘對基因聚合和作物品種改良具有重要的指導意義［42］。

［1］Buckler ES, Gaut BS, McMullen MD. Molecular and functional diversity of maize［J］. Curr Opin Plant Biol, 2006, 9（2）：172-176.

［2］Collard BC, Mackill DJ. Marker-assisted selection：an approach for precision plant breeding in the twenty-first century［J］. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 2008, 363（1491）：557-572.

［3］蓋鈞鎰, 趙團結. 中國大豆育種的核心祖先親本分析［J］. 南京農業大學學報, 2001, 24（2）：20-23.

［4］孫琦, 李文才, 于彥麗, 等. 美國商業玉米種質來源及系譜分析［J］. 玉米科學 , 2016, 24（1）：8-13.

［5］McCouch S. Diversifying selection in plant breeding［J］. PLoS Biol, 2004, 2（10）：e347.

［6］Slade AJ, Fuerstenberg SI, Loeffler D, et al. A reverse genetic,nontransgenic approach to wheat crop improvement by TILLING［J］. Nat Biotechnol, 2005, 23（1）：75-81.

［7］Uitdewilligen J, Wolters AMA, D’hoop BB, et al. A next-generation sequencing method for genotyping-by-sequencing of highly heterozygous autotetraploid potato［J］. PLoS One, 2013, 8（5）：e62355.

［8］Munoz-Amatriain M, Cuesta-Marcos A, Hayes PM, et al. Barley genetic variation ：implications for crop improvement［J］.Briefings in Functional Genomics, 2014, 13（4）：341-350.

［9］匡猛, 楊偉華, 許紅霞, 等. 分子標記技術在棉花品種鑒定上的研究進展［J］. 棉花學報, 2009, 21（4）：330-334.

［10］Hayashi K, Hashimoto N, Daigen M, et al. Development of PCR-based SNP markers for rice blast resistance genes at the Piz locus［J］. Theor Appl Genet, 2004, 108（7）：1212-1220.

［11］王昊龍, 韓俊杰, 李淼淼, 等. 功能標記的開發及在禾谷類作物中的應用［J］. 核農學報, 2014, 28（11）：1963-1971.

［12］He C, Holme J, Anthony J. SNP genotyping：the KASP assay［J］. Methods Mol Biol, 2014, 1145：75-86.

［13］ Ganal MW, Durstewitz G, Polley A, et al. A large maize（Zea mays L.）SNP genotyping array：development and germplasm genotyping, and genetic mapping to compare with the B73 reference genome［J］, PLoS One, 2011, 6（12）：e28334.

［14］Li R, Li Y, Fang X, et al. SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing［J］. Genome Res, 2009, 19（6）：1124-1132.

［15］Yamamoto T, Nagasaki H, Yonemaru J, et al. Fine definition of the pedigree haplotypes of closely related rice cultivars by means of genome-wide discovery of single-nucleotide polymorphisms［J］.BMC Genomics, 2010, 11：267.

［16］Xu X, Liu X, Ge S, et al. Resequencing 50 accessions of cultivated and wild rice yields markers for identifying agronomically important genes［J］. Nat Biotechnol, 2012, 30（1）：105-111.

［17］Li YD, Chu ZZ, Liu XG, et al. A cost-effective high-resolution melting approach using the EvaGreen dye for DNA polymorphism detection and genotyping in plants［J］. J Integr Plant Biol, 2010,52（12）：1036-1042.

［18］He C, Holme J, Anthony J. SNP genotyping：the KASP assay［J］. Methods Mol Biol, 2014, 1145：75-86.

［19］Zhou G, Zhang Q, Tan C, et al. Development of genome-wide InDel markers and their integration with SSR, DArT and SNP markers in single barley map［J］. BMC Genomics, 2015, 16（1）：804.

［20］Graves H, Rayburn AL, Gonzalez-Hernandez JL, et al. Validating DNA polymorphisms using KASP assay in prairie cordgrass（Spartina pectinata Link）Populations in the U. S［J］. Front Plant Sci, 2015, 6：1271.

［21］張小燕, 左明雪, 張占軍, 等. 用基因芯片檢測單核苷酸多態性反應原理［J］. 中國生物工程雜志, 2005, 25（11）：52-56.

［22］Peace C, Bassil N, Main D, et al. Development and evaluation of a genome-wide 6K SNP array for diploid sweet cherry and tetraploid sour cherry［J］. PLoS One, 2012, 7（12）：e48305.

［23］Chagne D, Crowhurst RN, Troggio M, et al. Genome-wide SNP detection, validation, and development of an 8K SNP array for apple［J］. PLoS One, 2012, 7（2）：e31745.

［24］Cavanagh CR, Chao S, Wang S, et al. Genome-wide comparative diversity uncovers multiple targets of selection for improvement in hexaploid wheat landraces and cultivars［J］. PNAS, 2013, 110（20）：8057-8062.

［25］Wang S, Wong D, Forrest K, et al. Characterization of polyploid wheat genomic diversity using a high-density 90, 000 single nucleotide polymorphism array［J］. Plant Biotechnol J, 2014, 12（6）：787-796.

［26］Unterseer S, Bauer E, Haberer G, et al. A powerful tool for genome analysis in maize：development and evaluation of the high density 600 k SNP genotyping array［J］. BMC Genomics, 2014, 15 ：823.

［27］Chen H, He H, Zhou F, et al. Development of genomics-based genotyping platforms and their applications in rice breeding［J］.Curr Opin Plant Biol, 2013, 16（2）：247-254.

［28］Yu H, Xie W, Li J, et al. A whole-genome SNP array（RICE6K）for genomic breeding in rice［J］. Plant Biotechnol J, 2014, 12（1）：28-37.

［29］Singh N, Jayaswal PK, Panda K, et al. Single-copy gene based 50 K SNP chip for genetic studies and molecular breeding in rice［J］.Sci Rep, 2015, 5：11600.

［30］McCouch SR, Wright MH, Tung CW, et al. Open access resources for genome-wide association mapping in rice［J］. Nat Commun,2016, 7：10532.

［31］Li JY, Wang J and Zeigler RS. The 3, 000 rice genomes project：new opportunities and challenges for future rice research［J］.Gigascience, 2014, 3：8.

［32］Duran C, Appleby N, Clark T, et al. AutoSNPdb：an annotated single nucleotide polymorphism database for crop plants［J］.Nucleic Acids Res, 2009, 37（suppl_1）：D951-953.

［33］Nijveen H, van Kaauwen M, Esselink DG, et al. QualitySNPng：a user-friendly SNP detection and visualization tool［J］. Nucleic Acids Res, 2013, 41（W1）：W587-590.

［34］Azam S, Rathore A, Shah T M, Telluri M, et al. An integrated SNP mining and utilization（ISMU）pipeline for next generation sequencing data［J］. PLoS One, 2014, 9（7）：e101754.

［35］Dereeper A, Homa F, Andres G, et al. SNiPlay3：a web-based application for exploration and large scale analyses of genomic variations［J］. Nucleic Acids Res, 2015, 43（W1）：W295-300.

［36］Yonemaru J-i, Ebana K, Yano M. HapRice, an SNP Haplotype Database and a Web Tool for Rice［J］, Plant Cell Physiol, 2014,55（1）：e9.

［37］Zhao H, Yao W, Ouyang Y, et al. RiceVarMap：a comprehensive database of rice genomic variations［J］. Nucleic Acids Res,2015, 43（D1）：D1018-1022.

［38］Consortium IRP. Information Commons for Rice（IC4R）［J］.Nucleic Acids Res, 2016, 44（D1）：D1172-1180.

［39］Wilkinson PA, Winfield MO, Barker GL, et al. CerealsDB 3.0：expansion of resources and data integration［J］. BMC Bioinformatics, 2016, 17：256.

［40］He Z, Zhai W, Wen H, et al. Two evolutionary histories in the genome of rice：the roles of domestication genes［J］. PLoS Genet, 2011, 7（6）：e1002100.

［41］Lestari P, Lee G, Ham TH, et al. Single nucleotide polymorphisms and haplotype diversity in rice sucrose synthase 3［J］. J Hered,2011, 102（6）：735-746.

［42］Yonemaru J, Yamamoto T, Ebana K, et al. Genome-wide haplotype changes produced by artificial selection during modern rice breeding in Japan［J］. PLoS One, 2012, 7（3）：e32982.

［43］Wang H, Vieira FG, Crawford JE, et al. Asian wild rice is a hybrid swarm with extensive gene flow and feralization from domesticated rice［J］. Genome Res, 2017, 27：1-10.

［44］Yang W, Guo Z, Huang C, et al. 15 genetic variation in rice［J］.Nat Commun, 2014, 5：5087.

［45］Xie W, Wang G, Yuan M, et al. Breeding signatures of rice improvement revealed by a genomic variation map from a large germplasm collection［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2015, 112（39）：E5411-5419.

［46］Biscarini F, Cozzi P, Casella L, et al. Genome-Wide Association Study for Traits Related to Plant and Grain Morphology, and Root Architecture in Temperate Rice Accessions［J］. PLoS One, 2016,11（5）：e0155425.

［47］Huang X, Yang S, Gong J, et al. Genomic architecture of heterosis for yield traits in rice［J］. Nature. 2016, 537（7622）：629-633.

［48］Rebolledo M C, Dingkuhn M, Courtois B, et al. Phenotypic and genetic dissection of component traits for early vigour in rice using plant growth modelling, sugar content analyses and association mapping［J］. J Exp Bot, 2015, 66（18）：5555-5566.

［49］Kumar V, Singh A, Mithra SV, et al. Genome-wide association mapping of salinity tolerance in rice（Oryza sativa）［J］. DNA Res, 2015, 22（2）：133-145.

［50］Rahman MA, Thomson MJ, Shah EAM, et al. Exploring novel genetic sources of salinity tolerance in rice through molecular and physiological characterization［J］. Ann Bot, 2016, 117（6）：1083-1097.

［51］Kang H, Wang Y, Peng S, et al. Dissection of the genetic architecture of rice resistance to the blast fungus Magnaporthe oryzae［J］. Mol Plant Pathol, 2016, 17（6）：959-972.

［52］寧洽, 劉文國, 楊偉光, 等. SNP 標記在玉米研究上的應用進展［J］. 玉米科學 , 2017, 25（1）：57-61.

［53］呂銳玲, 周強. 植物基因組選擇及其應用研究進展［J］. 中國農學通報, 2016, 32（15）：107-11.

High-throughput Genotyping Techniques and Their Applications in Rice

ZHANG Xian-wen1，2，3HE Zhi-zhou2JIANG Nan2DENG Hua-feng1Li Ji-ming2
（1. State Key Laboratory of Hybrid Rice，Hunan Hybrid Rice Research Center，Hunan Academy of Agricultural Sciences，Changsha 410125 ；2. Huazhi Rice Biotech Co.，Ltd.，Changsha 410125 ；3. College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128）

Deep understanding and efficient utilization of genetic basis of crop germplasm resources is of great importance for crop cultivar improvement and food safety. The traditional methods based on pedigree played a vital role in breeding practice. With the rapid development of molecular biology，genotyping methods based on genomics and high-throughput SNP markers have been developed and may efficiently identify the germplasm resources. This article reviews the main genotyping methods，focusing on the methods based on single nucleotide polymorphism（SNP）marker such as the next-generation sequencing（NGS），competitive allele-specific PCR（KASP），and SNP chip as well as the popular SNP analysis tools and databases. Furthermore，this article introduces the progresses of high-throughput SNP genotyping techniques in studying rice，and prospects the application and developmental trends of genotyping techniques in the fields such as crop breeding and so on.

pedigree；SNP；genotyping；next generation sequencing；competitive allele-specific PCR

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0467

2017-06-05

國家自然科學基金項目（31000125），中國博士后基金（2016M600627），雜交水稻國家重點實驗室（湖南雜交水稻研究中心）開放課題基金（2016KF05）

張先文，男，博士研究生，研究方向：水稻雜種優勢；E-mail：xianwenzhang@hunau.edu.cn

鄧華鳳，男，博士生導師，研究員，研究方向：水稻遺傳育種；E-mail：dhf@hhrrc.ac.cn李繼明，男，研究員，研究方向：水稻分子育種；E-mail：Jiming.li@wiserice.com

（責任編輯 朱琳峰）