廣西壯族自治區(qū)壯族人群白細(xì)胞介素23受體基因單核苷酸多態(tài)性分析

吳昭元，謝克恭，陸潞，盧賢哲，黃可，廖林波，唐毓金

(1右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西百色 533000；2右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

廣西壯族自治區(qū)壯族人群白細(xì)胞介素23受體基因單核苷酸多態(tài)性分析

吳昭元1，謝克恭2，陸潞2，盧賢哲2，黃可2，廖林波1，唐毓金2

(1右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西百色 533000；2右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

目的分析廣西壯族自治區(qū)壯族人群白細(xì)胞介素23受體(IL-23R)基因rs10889677、rs7530511位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(SNP)。方法采用SNaP shot SNP分型技術(shù)檢測150例廣西壯族人群IL-23R基因rs10889677、rs7530511位點(diǎn)SNP，并根據(jù)國際人類基因組計劃公布的中國北京、日本、墨西哥、印第安人群的SNP分型數(shù)據(jù)，比較上述5個人群兩位點(diǎn)的基因型、等位基因頻率。結(jié)果不同性別廣西壯族人群IL-23R基因rs10889677位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較無差異(P均>0.05)。廣西壯族人群與日本、墨西哥、印第安人群比較，IL-23R基因rs10889677位點(diǎn)AA、AC、CC基因型頻率和A、C等位基因頻率有差異(P均<0.05)；與北京人群比較，等位基因頻率有差異(P均<0.05)。廣西壯族人群與北京、墨西哥、印第安人群比較，IL-23R基因rs7530511位點(diǎn)CC、CT、TT基因型頻率和C、T等位基因頻率比較有差異(P均<0.05)；與日本人群比較，基因型頻率有差異(P均<0.05)。結(jié)論廣西壯族人群IL-23R基因rs10889677、rs7530511位點(diǎn)存在多態(tài)性且與其他種族人群相比存在差異性。

白細(xì)胞介素23受體基因；白細(xì)胞介素23受體基因rs10889677位點(diǎn)；白細(xì)胞介素23受體基因rs7530511位點(diǎn)；單核苷酸多態(tài)性

白細(xì)胞介素23(IL-23)是一種由p19亞基和p40亞基通過二硫鍵連接后產(chǎn)生的異源二聚體細(xì)胞因子，IL-23的受體復(fù)合物有IL-12Rβ1和IL-23R，其中IL-23R在介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)起主要作用，人IL-23R基因定位在人類1號染色體150 kb的位置上[1,2]。研究[3～5]發(fā)現(xiàn)，IL-23R基因多個位點(diǎn)存在多態(tài)性，這些多態(tài)性可能影響基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，并且與炎癥性腸病、酒精性股骨頭壞死、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、腫瘤等疾病的易感性有關(guān)。通過探究基因組核酸序列的遺傳變異、環(huán)境因素與某些疾病的關(guān)聯(lián)性來尋找疾病相關(guān)基因，不僅能對疾病的發(fā)病機(jī)制可更進(jìn)一步了解，同時為今后對某些疾病的易感性評估、早期診斷及藥物基因治療提供研究基礎(chǔ)。本文采用單核苷酸多態(tài)性(SNP)分型技術(shù)檢測150例廣西壯族人群IL-23R基因rs10889677、rs7530511位點(diǎn)的SNP，并通過美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)檢索Hap Map數(shù)據(jù)庫公布的中國北京、日本、墨西哥、印第安人群相應(yīng)的位點(diǎn)進(jìn)行比較分析，旨在為某些高發(fā)疾病進(jìn)行早期診斷及預(yù)防的相關(guān)研究提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 隨機(jī)選取2015年8月～2016年8月到廣西右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院進(jìn)行健康體檢的健康體檢者150例，男65例，女85例；年齡22～59(32.33±11.19)歲；所有研究對象籍貫均為廣西壯族自治區(qū)，民族為壯族，且無遺傳疾病史，排除高血壓、糖尿病等基礎(chǔ)疾病，各項實驗室檢查指標(biāo)基本正常，所有研究對象均知情同意。

1.2 IL-23R基因SNP分析方法 ①抽取受試者清晨、空腹外周靜脈血2 mL，置于枸櫞酸鈉抗凝管中，采用DNA提取試劑盒從血標(biāo)本中提取基因組DNA，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩＂诟鶕?jù)NCBI上查找的IL-23R易感基因，選擇包含IL-23R rs10889677、rs7530511位點(diǎn)的序列，利用在線軟件Primer3進(jìn)行引物設(shè)計。③取1 μL 1%agarose電泳對DNA樣本進(jìn)行質(zhì)量檢查以及濃度估計，然后根據(jù)估計的濃度將樣本稀釋到工作濃度(5～10 ng/μL)。④取20 μL 1×GC-I buffer(Takara.)、3.0 mmol/L Mg2+、0.3 mmol/L dNTP、1 U HotStarTaq polymerase(Qiagen Inc.)及1 μL樣本DNA和1 μL多重PCR引物進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，具體反應(yīng)條件如下：95 ℃、2 min；94 ℃、20 s，65 ℃、40 s，72 ℃、1.5 min，共11個循環(huán)；94 ℃、20 s，59 ℃、30 s，72 ℃、1.5 min，共24個循環(huán)；72 ℃、2 min，4 ℃保存。⑤在10 μL PCR產(chǎn)物中加入5 U SAP酶和2 U Exonuclease Ⅰ酶，37 ℃溫浴1 h，然后75 ℃滅活15 min進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化。⑥取5 μL SNaP shot Multiplex Kit(ABI)、2 μL純化后多重PCR產(chǎn)物、1 μL延伸引物混合物、2 μL超純水進(jìn)行SNaP shot多重單堿基延伸反應(yīng)。具體反應(yīng)條件如下：96 ℃、1 min；96 ℃、10 s，55 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共28個循環(huán)；4 ℃保存。⑦在10 μL延伸產(chǎn)物中加入1 U SAP酶，37 ℃溫浴1 h，然后75 ℃滅活15 min進(jìn)行延伸產(chǎn)物純化。⑧取0.5 μL純化后的延伸產(chǎn)物與0.5 μL Liz120 SIZE STANDARD、9 μL Hi-Di混勻，95 ℃變性5 min后使用ABI3730XL測序儀進(jìn)行測序，測序儀上收集的數(shù)據(jù)再使用軟件GeneMapper4.1進(jìn)行相應(yīng)位點(diǎn)SNP分型的分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。用Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗方法進(jìn)行基因型分布遺傳平衡吻合度檢驗，通過美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)檢索Hap Map數(shù)據(jù)庫公布的北京、日本、墨西哥、印第安人群相應(yīng)的位點(diǎn)進(jìn)行比較分析，2位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率采用χ2檢驗進(jìn)行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-23R基因兩位點(diǎn)測序結(jié)果 rs10889677位點(diǎn)的基因型有3種，分別是CC、CT、TT；rs7530511位點(diǎn)的基因型有3種，分別是CC、CA、AA。

2.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗結(jié)果 納入人群符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(P>0.05)，表明本實驗所選取人群的基因頻率可以代表廣西壯族人群的基因頻率。

2.3 不同性別廣西壯族人群IL-23R基因rs10889677位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較 結(jié)果見表1。由表1可知，不同性別廣西壯族人群IL-23R基因rs10889677位點(diǎn)基因型及等位基因頻率無差異(P均>0.05)。

表1 不同性別廣西壯族人群IL-23R基因rs10889677位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較

2.4 不同性別廣西壯族人群IL-23R基因rs7530511位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較 結(jié)果見表2。由表2可知，不同性別廣西壯族人群IL-23R基因rs7530511位點(diǎn)基因型及等位基因頻率無差異(P均>0.05)。

表2 不同性別廣西壯族人群IL-23R基因rs7530511位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較

2.5 廣西壯族人群IL-23R基因rs10889677位點(diǎn)基因型及等位基因頻率與其他種族人群比較 結(jié)果見表3。由表3可知，廣西壯族人群與日本、墨西哥、印第安人群比較，IL-23R基因rs10889677位點(diǎn)AA、AC、CC基因型頻率和A、C等位基因頻率有差異(P均<0.05)；與北京人群比較，基因型頻率無差異(P均>0.05)，等位基因頻率有差異(P均<0.05)。

表3 廣西壯族人群IL-23R基因rs10889677位點(diǎn)基因型及等位基因頻率與其他種族人群比較

2.6 廣西壯族人群IL-23R基因rs7530511位點(diǎn)基因型及等位基因頻率與其他種族人群比較 結(jié)果見表4。由表4可知，廣西壯族人群與北京、墨西哥、印第安人群比較，IL-23R基因rs7530511位點(diǎn)CC、CT、TT基因型頻率和C、T等位基因頻率比較有差異(P均<0.05)；與日本人群比較，基因型頻率有差異(P均<0.05)，等位基因頻率無差異(P均>0.05)。

表4 廣西壯族人群IL-23R基因rs7530511位點(diǎn)基因型及等位基因頻率與其他種族人群比較

3 討論

IL-23的受體復(fù)合物是由IL-23R和IL-12Rβ1兩個亞基共同組成的。IL-23R基因定位在人類1號染色體1p31.3上，是由胞外配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)三部分組成的Ⅰ型跨膜蛋白[6]。人的T淋巴細(xì)胞、樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的胞膜上均可表達(dá)IL-23R[7]。IL-23可與這些細(xì)胞表達(dá)的IL-23R特異性結(jié)合，通過IL-23R介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)實現(xiàn)其功能，通過Jak/Stat反應(yīng)途徑激活Jau激酶、酪氨酸蛋白激酶，磷酸化受體胞內(nèi)區(qū)Stat3為主的Stat結(jié)合位點(diǎn)，Stat分子以二聚體方式聚集及再次被磷酸化后入核，作用于下游的靶基因[8]。IL-23與IL-23R結(jié)合后，能促進(jìn)T細(xì)胞增殖及分化，誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，誘導(dǎo)TH17分泌IL-17相關(guān)的IL-17A、IL-17F、IL-22、GM-CSF等細(xì)胞因子，參與多種疾病如炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病等的過程[9]。

隨著遺傳學(xué)的發(fā)展，遺傳因素在疾病發(fā)生中的作用逐漸成為研究的重點(diǎn)，特別是多基因及環(huán)境因素共同作用的復(fù)雜疾病更是得到人們的重視。遺傳和環(huán)境因素可以使人基因組中出現(xiàn)SNP從而引起DNA序列的多態(tài)性，某些SNPs會直接改變基因蛋白順序，與某些性狀和疾病有直接的關(guān)系[10]。IL-23R基因序列在其外顯子、啟動子、內(nèi)含子或基因間區(qū)域均存在許多SNP位點(diǎn)。目前，國內(nèi)外關(guān)于IL-23R基因rs10889677、rs7530511位點(diǎn)多態(tài)性與疾病易感性的研究較多。Tang等[11]為了探討IL-23R基因的多態(tài)性與膀胱移行細(xì)胞癌相關(guān)性，對226例膀胱癌患者rs10889677位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，膀胱癌患者等位基因C的頻率顯著增加，提示IL-23R基因多態(tài)性可能在中國人群膀胱癌易感性中起重要作用。另外Liu等對IL-23R的3種常見位點(diǎn)(rs6682925、rs10889677、rs1884444)多態(tài)性與癌癥風(fēng)險之間的關(guān)系進(jìn)行Meta分析，IL-23R基因rs10889677位點(diǎn)多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病相關(guān)。Park等[12]對IL-23R多態(tài)性(rs7530511)與韓國人腦出血的關(guān)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)等位基因頻率與腦出血相關(guān)，表明IL-23R可能促進(jìn)了腦出血的發(fā)展。Lee等[13]對IL-23R、IL-12B多態(tài)性與牛皮癬易感性之間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了Meta分析，結(jié)果也提示歐洲人IL-23R rs7530511位點(diǎn)多態(tài)性與牛皮癬存在相關(guān)性。

本研究顯示，不同性別廣西壯族人群IL-23R rs10889677、rs7530511位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較均無統(tǒng)計學(xué)意義，說明該位點(diǎn)基因型分布可能與性別無關(guān)。本研究還顯示，廣西壯族人群與日本、墨西哥、印第安人群比較，IL-23R基因rs10889677位點(diǎn)AA、AC、CC基因型頻率和A、C等位基因頻率有差異；與北京人群比較，等位基因頻率有差異。廣西壯族人群與北京、墨西哥、印第安人群比較，IL-23R基因rs7530511位點(diǎn)CC、CT、TT基因型頻率和C、T等位基因頻率比較有差異；與日本人群比較，基因型頻率有差異。這也符合“親緣關(guān)系越近，其基因型分布越相似，反之則差異顯著”的遺傳學(xué)規(guī)律。可見不同的地域、種族之間的遺傳存在差異性，這些差異性可能導(dǎo)致某些疾病的高發(fā)、難治愈，這為今后進(jìn)一步研究廣西壯族人群中某些特異性高發(fā)疾病與IL-23R基因多態(tài)性之間的關(guān)系提供了參考。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.47.016

R331.1

B

1002-266X(2017)47-0053-03

國家自然科學(xué)基金應(yīng)急管理項目(81541136)。

唐毓金(E-mail: tangyujin196709@163.com)

2017-07-18)