舌靜脈注射沒食子酸的慢性低灌注大鼠學習記憶能力及腦氧化應激損傷相關指標觀察

尚運之，翟志永

(中國醫科大學附屬盛京醫院，沈陽 110014)

舌靜脈注射沒食子酸的慢性低灌注大鼠學習記憶能力及腦氧化應激損傷相關指標觀察

尚運之，翟志永

(中國醫科大學附屬盛京醫院，沈陽 110014)

目的觀察舌靜脈注射沒食子酸(GA)的慢性低灌注大鼠學習記憶能力及腦氧化應激損傷相關指標變化。方法48只大鼠隨機分為4組各12只。A、B組大鼠制備慢性低灌注模型，A組在制模前后各5天舌靜脈注射100 mg/kg GA，B組給予等量生理鹽水；C、D組參照A組手術方法處理大鼠但不結扎雙側頸總動脈，C組在手術前后各5天舌靜脈注射100 mg/kg GA，D組給予等量生理鹽水。比較各組大鼠的學習記憶能力(逃避潛伏期、目標象限所用時間百分比、游泳速度)及腦氧化應激損傷相關指標[超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、總硫醇(TT)]。結果與D組比較，B組第1～4天逃避潛伏期增加(P均<0.05)；與B組比較，A組第1～4天逃避潛伏期減少(P均<0.05)。與D組比較，B組目標象限所用時間百分比減少(P均<0.05)；與B組比較，A、C組目標象限所用時間百分比增加(P均<0.05)。與D組比較，B組SOD、GSH-Px、TT降低，MDA升高(P均<0.05)；與B組比較，A組和C組SOD、GSH-Px、TT升高，MDA降低(P均<0.05)。結論GA能改善慢性低灌注大鼠的學習記憶能力及修復腦氧化應激損傷。

沒食子酸；慢性腦低灌注；學習記憶能力；氧化應激

隨著我國人民生活水平的提高和生活方式的改變，高血脂、高血糖、高血壓疾病頻發，腦血管病的發病率及病死率也居高不下[1,2]。慢性腦低灌注狀態是血管性癡呆、阿爾茨侮默病(AD)、Binswanger病等多種腦血管疾病發展過程中的一個共同病理過程[3,4]。沒食子酸(GA)是一種很好的神經保護劑[5]，具有羧基、羥基的芳香族化合物和可水解單寧的組成部分。GA廣泛存在于五倍子、茶葉、葡萄、葉下珠、石榴等植物中，具有抗氧化、清除自由基、抗癌、抗炎、抗真菌等多種作用，還可以用于治療糖尿病[6]。本研究觀察了舌靜脈注射GA的慢性低灌注大鼠學習記憶能力及腦氧化應激損傷相關指標變化，旨在為慢性腦低灌注所致的認知功能障礙疾病的治療提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性Wistar大鼠48只，體質量200～250 g，清潔級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 主要試劑及儀器 5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、GA購自Sigma-Aldrich公司，純度>95%；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)測定試劑盒購自上海信裕生物技術有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒由Randox Company提供；其余試劑都是使用分析純試劑，購自國藥集團化學試劑有限公司。MD-100半自動生化測定儀購自上海益聯科教設備有限公司；UV2450-紫外分光光度計購自日本島津；大鼠Morris水迷宮及分析軟件購自上海多毅實業有限公司；Eppendorf 5424R低溫離心機購自德國Eppendorf。

1.3 GA給予方法及慢性低灌注模型制備 48只大鼠隨機分為A、B、C、D組各12只。A、B組參照文獻[7,8]方法(大鼠仰臥位固定，頸部常規消毒鋪巾后，在頸腹側正中切開皮膚，逐層剝離肌肉，暴露頸總動脈，小心分離伴行的迷走神經，將雙側頸總動脈用雙重絲線結扎，縫合皮膚)制備慢性低灌注模型，A組在制模前后各5天舌靜脈注射100 mg/kg GA[9]，B組給予等量生理鹽水；C、D組參照A組手術方法處理大鼠但不結扎雙側頸總動脈，C組在制模前后各5天舌靜脈注射100 mg/kg GA，D組給予等量生理鹽水。

1.4 大鼠學習記憶能力評價 注射GA結束后次日(手術結束后第6天)，用Morris水迷宮實驗來測定各組大鼠的學習記憶能力。Morris水迷宮由帶站臺的水池、自動攝像機及Morris水迷宮數據處理軟件三部分組成。在測試前將水和牛奶的混合物注入池中，水深30 cm(水面高出站臺表面1 cm，大鼠見不到站臺)，水溫(26±1)℃。實驗環境要求在隔音、光線偏暗的室內，各次實驗間相應的條件保持不變。在實驗前1 d，將每只大鼠頭部標記，試驗周期共4 d，前3 d為訓練階段，第4天為測試階段。訓練階段每天訓練3次，入池位置分別為站臺所對及相鄰象限，將大鼠置于象限邊緣1/2弧度處，并且頭朝池壁入水，大鼠入水時攝像機開始記錄且Morris水迷宮數據處理軟件開始記錄及計算。①逃避潛伏期：記錄大鼠每次入水到游到站臺的時間(s)，如大鼠在120 s仍內未找到站臺，可在第120 s時將其放置在站臺上，此時潛伏期記為120 s，大鼠到達站臺后，使其在站臺上停留15 s；②目標象限所用時間百分比：在第4天的測試階段移除站臺，將大鼠從原站臺所對象限中面向池壁輕輕放入池中自由游泳60 s，記錄大鼠花費在原站臺所在象限中的時間，并除以60 s，所得為目標象限所占時間百分比；③游泳速度：記錄大鼠每次訓練及測試時的游泳速度，并取平均值。數據采集及圖像分析均由圖像自動監視和處理系統完成[10]。

1.5 大鼠腦氧化應激損傷相關指標檢測 Morris水迷宮實驗結束后第2天，各組大鼠斷頭取腦，分離腦皮層，制備出10%的組織勻漿液。ELISA法測定SOD活性及MDA含量，具體操作方法嚴格按照試劑說明書進行測定。GSH-Px檢測采用比色法，嚴格按照GSH-Px試劑盒說明書測定。總硫醇(TT)使用DTNB作為還原劑測定。1 mL tris-EDTA(pH 8.6)緩沖溶液加入50 μL腦勻漿液中，然后定容在紫外分光光度412 nm測定。之后加入20 μL DTNB試劑(10 mmol/L溶液)加入到上述溶液15 min后再測定，然后根據他們的比值計算濃度[11]。

2 結果

2.1 各組大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期比較 結果見表1。

表1 實驗第1～4天各組大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期比較

注：與D組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05。

2.2 各組大鼠Morris水迷宮目標象限所用時間百分比及游泳速度比較 結果見表2。

表2 各組大鼠Morris水迷宮目標象限所用時間百分比及游泳速度比較

注：與D組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05。

2.3 各組大鼠腦皮層SOD、MDA、GSH-Px、TT水平比較 結果見表3。

表3 各組大鼠腦皮層SOD、MDA、GSH-Px、TT水平比較

注：與D組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05。

3 討論

隨著多種新技術在神經科臨床的應用，臨床醫師對慢性低灌注狀態的研究得到越來越多的認識和重視[12]。慢性低灌注是指由動脈狹窄所致腦組織血供長期低于生理閾值而出現慢性缺血性神經系統功能損害的病理狀態，可能與腦白質疏松、血管性癡呆、短暫性腦缺血發作、動脈硬化性腦梗死等發病有關[13～16]，大量臨床研究[17,18]也觀察到輕度認知功能障礙、血管性癡呆(VD)、AD患者腦血流量減少，提示腦血流降低與神經元凋亡、認知障礙及癡呆的進展密切相關。永久性結扎大鼠雙側頸總動脈可導致其大腦慢性不完全性缺血，是目前最常用的VD動物模型[19]。多項研究[20,21]表明，在低灌注狀態下，認知功能會發生減退，同時伴隨有腦部自由基代謝的紊亂，這也是低灌注對腦實質和腦微血管系統造成損害的重要機制。當慢性低灌注發生時，氧化應激機制啟動，而氧化應激已被廣泛研究證實是導致神經細胞缺血性損傷的重要致病原因之一[1,22]。另外，活性氧物質還可使線粒體產生氧化性病理損傷[23]。

GA是多種中藥及其復方制劑中重要的功效成分，廣泛存在于葡萄、茶葉、五倍子、刺云、實豆莢等植物中，其酯類化合物作為抗氧化劑被廣泛應用于食品、制藥及輕工等行業。已有的研究發現，GA具有明顯抗腫瘤[24]、抗炎、抗病毒、抗真菌及心腦血管保護[25]和抗氧化[26]等藥理作用。有報道[23]顯示，大鼠雙側頸總動脈結扎后有15個腦區的局部腦血流量降低25%～87%。本研究顯示，與D組比較，B組第1～4天逃避潛伏期增加；與B組比較，A組第1～4天逃避潛伏期減少。與D組比較，B組目標象限所用時間百分比減少；與B組比較，A、C組目標象限所用時間百分比增加。表明雖然處于慢性低灌注時，缺血缺氧狀態會對學習記憶功能產生持續作用，但GA可以使這種學習記憶功能下降的趨勢有所減弱，從而改善認知功能。

在缺氧狀態下，具有抗氧化活性的物質SOD、過氧化氫酶、GSH-Px等減少，過氧化脂質產物MDA增加，外源性給予抗氧化酶或自由基清除劑，對缺血及再灌注心肌有明顯保護作用，因此MDA含量可間接反映氧自由基的產生與組織的損傷程度，而SOD活性與GSH-Px則可直接反映機體清除自由基和抗脂質過氧化的能力[23，27]。本研究顯示，與D組比較，B組SOD、GSH-Px降低，MDA升高；與B組比較，A組和C組SOD、GSH-Px升高，MDA降低。說明GA對這些參與到氧化應激反應中酶促的相關因子都有一定的調節作用。另外，GA也能參與到非酶促的氧化應激反應中[6]。本研究還顯示，與D組比較，B組TT降低；與B組比較，A、C組TT升高。表明GA對非酶促的氧化應激反應也有積極的作用。但是我們的實驗也發現，GA處理只能使大鼠經手術后SOD、GSH-Px、MDA、TT恢復到機體內的基礎水平，并不能通過GA的作用促使這些指標水平超過大鼠機體基礎水平。因而我們的研究進一步說明，GA并不能增加大鼠機體氧化應激相關因子的基礎水平，只是在氧化應激相關因子水平發生改變時才會做出相應的改變。造成這一結果可能的推測是，機體內可能存在一種反饋的機制，SOD、GSH-Px、MDA、TT超出基礎水平時，會產生其他的反應途徑轉化這些氧化應激相關的因子[28]。

總之，GA能改善慢性低灌注大鼠的認知缺陷及修復腦氧化應激損傷，GA對認知與神經保護作用的增強是與氧化應激作用相關，但本實驗未能直接證明GA如何與這些因子相互作用。由于慢性低灌注引起的損傷會產生一個復雜的級聯反應，其中會涉及到多種的信號通路，因此如何更進一步的研究該機制，還需要從細胞水平、分子代謝及信號傳導通路等不同角度去挖掘，進而為慢性低灌注所致的認知功能障礙疾病的治療提供幫助。

[1] Safouris A, Hambye AS, Sculier C, et al. Chronic brain hypoperfusion due to multi-vessel extracranial atherosclerotic disease: a potentially reversible cause of cognitive impairment[J]. J Alzheimers Dis, 2015,43(1):23-27.

[2] 張建斌,李小慧.石榴汁對慢性腦低灌注大鼠認知行為的影響及其作用機制研究[J].中國生化藥物雜志,2015,35(3):58-61.

[3] 賈寧,韓錕.EGCG改善APP/PS1轉基因小鼠認知功能及減輕海馬胰島素抵抗的機制研究[J].中國生化藥物雜志,2014,34(1):12-15.

[4] Salminen A, Jouhten P, Sarajarvi T, et al.Hypoxia and GABA shunt activation in the pathogenesis of Alzheimer′s disease[J].Neurochem Int, 2015,23(5):423-430.

[5] 謝曉艷,劉洪濤,張吉,等.沒食子酸體外抗氧化作用研究[J].重慶醫科大學學報,2011,36(3):319-322.

[6] 于艷華,卜麗梅,趙麗紅,等.沒食子酸對缺血再灌注損傷大鼠的保護作用[J].中國老年學雜志,2010,30(20):2935-2937.

[7] Roohbakhsh A, Moghaddam AH, Massoudi R, et al. Role of dorsal hippocampal cannabinoid receptors and nitric oxide in anxiety like behaviours in rats using the elevated plus-maze test[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2007,4(3):223-229.

[8] Xu X, Li Z, Yang Z, et al. Decrease of synaptic plasticity associated with alteration of information flow in a rat model of vascular dementia[J]. Neuroscience, 2012,206:136-143.

[9] Hsu CL, Yen GC. Effect of gallic acid on high fat diet-induced dyslipidaemia, hepatosteatosis and oxidative stress in rats[J]. Br J Nutr, 2007,98(4):727-735.

[10] 趙玲,劉麗,李雅莉,等.慢性腦低灌注狀態對大鼠學習記憶功能及腦組織自由基代謝的影響[J].中國行為醫學科學,2005,14(11):961-963.

[11] Sarkaki A, Fathimoghaddam H, Mansouri SM, et al. Gallic acid improves cognitive, hippocampal long-term potentiation deficits and brain damage induced by chronic cerebral hypoperfusion in rats[J]. Pak J Biol Sci, 2014,17(8):978-990.

[12] 鄒璨,郝磊,田洪,等.慢性腦低灌注后失交感神經支配對腦動脈生成的影響[J].第三軍醫大學學報,2015,37(18):1818-1822.

[13] Narantuya D, Nagai A, Sheikh AM, et al.Microglia transplantation attenuates white matter injury in rat chronic ischemia model via matrix metalloproteinase-2 inhibition[J]. Brain Res, 2010,1316:145-152.

[14] Kwon KJ, Lee EJ, Kim MK, et al. Diabetes augments cognitive dysfunction in chronic cerebral hypoperfusion by increasing neuronal cell death: implication of cilostazol for diabetes mellitus-induced dementia[J]. Neurobiol Dis, 2015,73:12-23.

[15] Hotter B, Ostwaldt AC, Levichev-Connolly A, et al. Natural course of total mismatch and predictors for tissue infarction[J]. Neurology, 2015,85(9):770-775.

[16] Safouris A, Hambye AS, Sculier C, et al. Chronic brain hypoperfusion due to multi-vessel extracranial atherosclerotic disease: a potentially reversible cause of cognitive impairment[J]. J Alzheimers Dis, 2015,43(1):23-27.

[17] Schuff N, Matsumoto S, Kmiecik J, et al. Cerebral blood flow in ischemic vascular dementia and Alzheimer′s disease, measured by arterial spin-labeling magnetic resonance imaging[J]. Alzheimers Dement, 2009,5(6):454-462.

[18] Kume K, Hanyue H, Sato T, et al. Vascular risk factors are associated with faster decline of Alzheimer disease: alongitudinal SPECT study[J]. J Neurol, 2011,258(7):1295-1303.

[19] Farkas E, Luiten PG, Bari F. Permanent, bilateral common carotid artery occlusion in the rat: a model for chronic cerebral hypoperfusion-related neurodegenerative diseases[J]. Brain Res Rev, 2007,54(1):162-180.

[20] Gupta S, Singh P, Sharma BM, et al. Neuroprotective effects of agomelatine and vinpocetine against chronic cerebral hypoperfusion induced vascular dementia[J]. Curr Neurovasc Res, 2015,12(3):240-252.

[21] Jing Z, Shi C, Zhu L, et al. Chronic cerebral hypoperfusion induces vascular plasticity and hemodynamics but also neuronal degeneration and cognitive impairment[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2015,35(8):1249-1259.

[22] Yang Y, Zhang J, Xiong L, et al. Cognitive improvement induced by environment enrichment in chronic cerebral hypoperfusion rats: a result of upregulated endogenous neuroprotection[J]. J Mol Neurosci, 2015,56(2):278-289.

[23] Sweet JG, Chan SL, Cipolla MJ. Effect of hypertension and carotid occlusion on brain parenchymal arteriole structure and reactivity[J]. J Appl Physiol, 2015,119(7):817-823.

[24] Shi L, Lei Y, Srivastava R, et al. Gallic acid induces apoptosis in human cervical epithelial cells containing human papillomavirus type 16 episomes[J]. J Med Virol, 2016,88(1):127-134.

[25]卜麗梅,關鳳英,喬萍,等.沒食子酸對大鼠缺血再灌注損傷后細胞凋亡的保護作用及機制研究[J].中國實驗診斷學,2010,14(11):1693-1697.

[26] de Cristo Soares Alves A, Mainardes RM, Khalil NM. Nanoencapsulation of gallic acid and evaluation of its cytotoxicity and antioxidant activity[J]. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl, 2015,60(3):213-215.

[27] Choi JY, Cui Y, Kim BG. Interaction between hypertension and cerebral hypoperfusion in the development of cognitive dysfunction and white matter pathology in rats[J]. Neuroscience, 2015,303:115-125.

[28] Ma L, Lu ZN, Hu P, et al. Neuroprotective effect of escitalopram oxalate in rats with chronic hypoperfusion[J]. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci, 2015,35(4):514-518.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.47.010

R741.05

A

1002-266X(2017)47-0035-04

翟志永(E-mail：snezzy@sj-hospital.org)

2017-07-25)