皮下注射重組人生長激素對血管性癡呆大鼠學習記憶能力、空間探索能力的影響及其機制探討

尹加珍，李蓓華，李國春，張紅，黃新武

(1西南醫科大學藥學院藥理教研室，四川瀘州 646000；2西南醫科大學附屬中醫醫院)

皮下注射重組人生長激素對血管性癡呆大鼠學習記憶能力、空間探索能力的影響及其機制探討

尹加珍1,2，李蓓華1，李國春2，張紅1，黃新武1

(1西南醫科大學藥學院藥理教研室，四川瀘州 646000；2西南醫科大學附屬中醫醫院)

目的觀察重組人生長激素(rhGH)對血管性癡呆(VD)大鼠學習記憶能力、空間探索能力的影響，并探討其可能機制。方法45只大鼠隨機分為實驗組、模型組、正常組各15只，其中實驗組和模型組通過不同時間點雙側頸總動脈結扎法(結扎左側頸總動脈3 d后再結扎右側頸總動脈)制備VD模型，正常組用同樣方法分離雙側頸總動脈，但不結扎頸總動脈；造模后第1天開始，實驗組大鼠頸部皮下注射rhGH(0.2 IU/100 g)，正常組和模型組給予等量生理鹽水，1次/d，連續28 d。采用水迷宮實驗評價大鼠學習記憶能力及空間探索能力，ELISA法檢測血清、皮質、海馬中血管內皮生長因子(VEGF)、胰島素樣生長因子1(IGF-1)、生長激素(GH)，TUNEL凋亡染色觀察神經元凋亡情況[以積分光密度值(IOD值)表示]。結果與正常組比較，實驗組第1～4天及模型組第1～6天逃避潛伏期長(P均<0.05)；與模型組比較，實驗組第2、4、5、6天逃避潛伏期短(P均<0.05)。與模型組比較，實驗組、正常組經過平臺次數多(P均<0.05)。與模型組比較，實驗組血清、皮質、海馬中VEGF、IGF-1、GH水平升高(P均<0.05)；與正常組比較，模型組血清、皮質、海馬中VEGF、IGF-1、GH水平降低(P均<0.05)。與模型組比較，實驗組、正常組海馬TUNEL凋亡染色IOD值降低(P均<0.05)。結論rhGH可改善VD大鼠學習記憶能力、空間探索能力，其機制可能與其可增加血清、皮質、海馬中VEGF和IGF-1水平有關。

血管性癡呆；重組人生長激素；血管內皮生長因子；胰島素樣生長因子

血管性癡呆(VD)是指由各種腦血管疾病導致的腦功能障礙從而產生大腦智能及認知功能障礙的臨床綜合征[1]，誘因以慢性腦缺血最為常見，其主要臨床表現為學習及記憶能力的障礙[2]。近年來，隨著人口老齡化比率增加，VD發病率日漸增高。據國外資料報道，VD是迄今為止惟一可防治的癡呆，早期干預治療具有可逆性[3]。目前，關于VD預防的研究取得了很大的進展，但仍缺乏有效的治療手段和藥物，因此探索VD的發病機制以及治療方法具有重要意義[4,5]。研究[6～8]發現，胰島素樣生長因子1(IGF-1)、血管內皮生長因子(VEGF)對缺血缺氧的病理改變具有重要的作用。重組人生長激素(rhGH)能促進神經修復、神經再生和神經發育，具有強大的神經保護作用[9]。然而，rhGH對VD大鼠的學習記憶是否有改善作用？IGF-1、VEGF與VD之間的關系及rhGH對腦缺血大鼠IGF-1、VEGF有何影響至今未見報到。本研究觀察了rhGH對VD大鼠學習記憶能力、空間探索能力的影響，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠45只，體質量(200±10)g，SPF級，由西南醫科大學SPF動物醫學實驗中心提供。

1.2 藥物、試劑、儀器 注射用rhGH購自安徽安科生物工程(集團)股份有限公司。大鼠(Rat)生長激素(GH)ELISA檢測試劑盒、大鼠(Rat)VEGF ELISA檢測試劑盒、大鼠(Rat)IGF-1 ELISA檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。低溫離心機(ST16R)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司，Morris水迷宮購自成都泰盟科技有限公司，SpectraMax?M3多功能酶標儀購自Molecular Devices公司。

1.3 VD模型制備及rhGH給予方法 45只大鼠隨機分為實驗組、模型組、正常組各15只，其中實驗組和模型組通過不同時間點雙側頸總動脈結扎法(結扎左側頸總動脈3 d后再結扎右側頸總動脈)制備VD模型[10,11]。正常組用同樣方法分離雙側頸總動脈，但不結扎頸總動脈。造模后第1天開始，實驗組大鼠頸部皮下注射rhGH(0.2 IU/100 g)，正常組和模型組給予等量生理鹽水，1次/d，連續28 d。4周后正常組除去死亡的剩余13只，模型組和實驗組經過水迷宮篩選出學習記憶能力明顯障礙的大鼠，每組13只。

1.4 大鼠學習記憶能力及空間探索能力評價 采用水迷宮實驗。Morris水迷宮中加入牛奶使水呈乳白色，水深沒過平臺約2 cm，水溫控制在(26±1)℃。設備固定后不再移動，實驗期間實驗室的燈光和布置保持不變，盡量排除干擾因素。①定位航行：歷時6 d，每次將實驗動物分別從4個入水點面朝池壁輕輕放入水中，記錄大鼠從入水至找到平臺的游泳軌跡及逃避潛伏期。每次時間為120 s，如果120 s內未找到平臺，則由實驗者用手牽引其至平臺上停留20 s，并記錄潛伏期為120 s，每次實驗后用干毛巾將大鼠擦干放入籠中。2次/d，連續6 d，計算平均成績，此時的逃避潛伏期作為評價大鼠學習記憶能力的指標。②空間探索：在定位航行實驗后，撤去平臺，選擇離原平臺所在處最遠的象限為入水點將大鼠放入水中，記錄其在120 s內游泳經過原平臺所在處的次數，將其作為評價大鼠空間探索能力的指標。

1.5 大鼠血清和腦組織VEGF、IGF-1、GH檢測 實驗結束后，禁食12 h，禁水4 h。各組大鼠隨機取8只，稱重，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(0.15 mL/100 g)麻醉，腹主動脈取血，加入含抗凝劑的真空采血管中，室溫放至凝固，在4 ℃條件下以3 000 r/min離心10 min，分離血清，分裝于EP管中，-80 ℃保存，測定前室溫下復蘇。大鼠取血后，斷頭取腦，立即分離大鼠的皮質和海馬，稱重，分別按組織重量(g)∶生理鹽水(mL)=1∶10的比例制作10%勻漿，4 ℃條件下以3 000 r/min離心10 min，棄去沉淀，取其清液，分裝，-80 ℃保存。 采用ELISA雙抗體夾心法的原理，往預先包被VEGF、IGF-1、GH抗體的包被微孔中，依次加入待測樣本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和待測樣本中VEGF、IGF-1、GH呈正相關。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度值(OD值)，并將其在標準曲線下換算成濃度。

1.6 大鼠海馬神經元TUNEL凋亡染色IOD值測算 各組另取5只大鼠，取腦組織包埋切片，進行TUNEL凋亡染色，觀察神經元凋亡情況。按照試劑盒說明書步驟進行染色。切片脫蠟及水合后滴加蛋白酶K工作液，滴加50 μL的TUNEL反應液(TdT酶溶液與Dutp標記液按照1∶9比例混合)于37 ℃濕盒中60 min、PBS漂洗、加POD轉化劑50 μL于25 ℃濕盒10 min、PBS漂洗、DAB顯色，鏡下控制、蘇木素復染，梯度酒精脫水，透明，封片。各組大鼠腦組織進行連續切片，每個腦組織均勻間隔選取5張進行染色，在10×40倍鏡下于海馬CA1區隨機選取3個視野，采用IPP圖像處理軟件，測量積分光密度值(IOD值)，取平均值作為每張切片的IOD值。

2 結果

2.1 各組大鼠定位航行實驗逃避潛伏期比較 結果見表1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期比較

注：與正常組比較，★P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05。

2.2 各組大鼠空間探索實驗經過平臺次數比較 實驗組、模型組、正常組經過平臺次數分別為(3.14±1.50)、(1.32±1.19)、(5.87±3.27)次，模型組與正常組比較，實驗組與模型組比較，P均<0.05。

2.3 各組大鼠血清VEGF、IGF-1、GH水平比較 結果見表2。

表2 各組大鼠血清VEGF、IGF-1、GH水平比較

注：與模型組比較，▲P<0.05；與正常組比較，★P<0.05。

2.4 各組大鼠皮質和海馬VEGF、IGF-1、GH表達比較 結果見表3。

表3 各組大鼠皮質和海馬VEGF、IGF-1、GH表達比較

注：與模型組比較，▲P<0.05；與正常組比較，★P<0.05。

2.5 各組大鼠海馬TUNEL凋亡染色IOD值比較 實驗組、模型組、正常組海馬TUNEL凋亡染色IOD值分別為165.30±16.51、275.02±20.60、75.99±4.95，實驗組、正常組分別與模型組比較，P均<0.05。

3 討論

VD是各種腦血管疾病導致的腦功能受損，誘因以慢性腦缺血最為常見，其主要臨床表現為學習與記憶能力障礙。研究[12]表明，中國60歲及以上的老年人中，VD患病率高達1.1%。目前，臨床常采取活血化淤等藥物改善VD患者血液循環，擬膽堿藥物改善患者學習記憶能力[13,14]，但效果不是特別理想。

rhGH是由基因工程合成具有與人體內源性生長激素相同結構的蛋白質類激素，與內源性生長激素具有同等的作用，有促進內皮細胞增殖、抑制缺氧導致的內皮細胞凋亡、神經保護等作用[9]。劉海濤等[15]應用線栓法制作大鼠腦缺血/再灌注損傷模型，給予rhGH干預，并在干預后的7、14、21 d運用免疫組化法測定凋亡細胞和Nestin表達，發現神經元凋亡數較對照組明顯減少，Nestin的表達顯著增加，說明rhGH可抑制缺血性腦損傷后細胞的凋亡，促進神經細胞和神經干細胞增殖，從而減少神經元損傷和促進神經元修復。研究發現，腹腔注射rhGH能減小大腦中動脈供血區缺血梗死模型大鼠腦組織含水量、梗死體積，兩者均明顯低于缺血組。張曄等[16]采用線栓法制備SD大鼠大腦永久性閉塞模型，皮下注射rhGH后觀察到大鼠腦缺血致腦梗死面積差異和神經能力恢復情況，提示rhGH能顯著減小大鼠持續性腦缺血后的腦梗死面積，對大鼠神經功能的恢復有明顯改善。本研究顯示，與模型組比較，實驗組逃避潛伏期短，穿過平臺的次數多，海馬CA1區凋亡神經元數量減少，說明rhGH可以顯著改善VD大鼠的學習記憶能力和空間探索能力。

生長激素(GH)是由垂體前葉嗜酸細胞所分泌的非糖基化蛋白，主要功能是促進肌肉組織蛋白質合成，增加肌肉體積和肌肉力量，促進機體的生長，GH可以促進神經修復、神經再生和神經發育，具有強大的神經保護作用。VEGF通過作用于血管內皮細胞，促進血管生成，增加血管密度，改善缺血區的血液循環，改善神經系統的功能[17]。GH直接或間接地通過IGF-1來發揮作用。正常情況下，GH通過肝臟受體促進肝臟IGF-1基因的表達，從而促進IGF-1的合成和釋放，血清中IGF-1通過反饋調節抑制垂體釋放GH，使得血液中GH和IGF-1處于平衡狀態[18]。局灶性腦缺血大鼠側腦室注射IGF-1，發現腦組織VEGF蛋白、mRNA表達增加，缺血性腦組織的病理損傷減輕，提示GH促進IGF-1合成的同時，可以間接增加VEGF水平[19]。VD患者GH的分泌受到抑制，眾多實驗表明VD的發生發展與IGF-1、VEGF有緊密的聯系。本研究發現，實驗組血清、皮質、海馬中VEGF、IGF-1、GH水平均高于模型組。表明rhGH可能通過增加VD大鼠IGF-1和VEGF的水平從來減少神經元凋亡，提高學習記憶能力，改善其認知功能障礙。

[1] 張允嶺,梅建勛,謝穎楨,等.老年期血管性癡呆分期分證探討[J].中醫雜志,2008,49(2):173-175.

[2] 張崗,王發渭.血管性癡呆的中醫臨床研究新進展[J].時珍國醫國藥,2010,21(3):769-771.

[3] Gorelick PB. Status of risk factors for dementia associated with stroke[J].Stroke, 1997,28(2):459-463.

[4] He Z, Pan Z, Lu W. Neuroprotective effects of tanshinone Ⅱ A on vascular dementia in rats[J]. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 2010,35(14):1883-1886.

[5] 肖迎春,劉楠,周宜燦,等.文拉法辛對血管性癡呆模型大鼠學習記憶功能的影響[J].中華老年醫學雜志,2012,31(11):1027-1030.

[6] Lin S, Fan LW, Pang Y, et al. IGF-1 protects oligodendrocyte progenitor cells and improves neurological functions following cerebral hypoxia-ischemia in the neonatal rat[J]. Brain Research, 2005,1063(1):15-26.

[7] 黃體秀,張紅.鼠神經生長因子治療新生兒缺氧缺血性腦病的臨床療效及神經保護作用[J].河北醫學,2014,20(12):1956-1958.

[8] 廖德榮,劉啟功,程燕子,等.血管內皮生長因子拮抗缺氧誘導的血管內皮細胞凋亡及其機制研究[J].中國現代醫學雜志,2007,17(22):2732-2735.

[9] 孫曉靜,張皓.生長激素在神經系統疾病治療中的作用[J].中國康復理論與實踐,2015,21(1):54-57.

[10] 黃新武,李華,秦大蓮,等.不同時點分別結扎左、右頸總動脈建立大鼠血管性癡呆模型[J].中國老年學雜志,2010,30(14):2006-2007.

[11] 任瑩,劉靜,申秀萍,等.不同亞型血管性癡呆的動物模型研究進展[J].山東醫藥,2012,52(35):97-99.

[12] 劉伯源,王久玲,肖義澤.中國60歲及以上人群老年期癡呆患病率Meta分析[J].中華流行病學雜志,2016,37(11):1541-1545.

[13] Zhang LD, Gong XJ, HU MM, et al. Anti-vascular dementia effect of gastrodin and its mechanism of action[J].Chin J Nat Med, 2008,6(2):130-134.

[14] 于飛,孫永馨.血管性癡呆大鼠模型的治療方法研究進展[J].中國比較醫學雜志,2014,19(9):66-71.

[15] 劉海濤,白宏英,曾志磊,等.重組人生長激素對腦缺血/再灌注損傷細胞凋亡及Nestin表達的影響[J].中國實用神經疾病雜志,2010,13(1):39-41.

[16] 張曄,王旭開,楊成明,等.重組人生長激素對AMI大鼠缺血心肌VEGF表達的影響及其生物學效應[J].第三軍醫大學學報,2004,26(13):1148-1151.

[17] Zimmerman MW, McQueeney KE, Isenberg JS, et al. PTP4A3 phosphatase promotes VEGF signaling and enables endothelial cell motility[J]. J Biol Chem, 2014,289(9):5904-5913.

[18] 上官芳芳,施建農.生長激素/IGF-1對認知功能的影響[J].中國心理衛生雜志,2007,21(8):568-570.

[19] Wang Y, Kilic E, Kilic U, et al. VEGF overexpression induces post-ischaemic neuroprotection, but facilitates haemodynamic steal phenomena[J]. Brain, 2005,128(Pt 1):52-63.

Effectsofsubcutaneousinjectionofrecombinanthumangrowthhormoneonabilityoflearning,memory,andspatialexplorationofratswithvasculardementia

YINJiazhen1,LIBeihua,LIGuochun,ZHANGHong,HUANGXinwu

(1SchoolofPharmacy,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China)

ObjectiveTo observe the effects of recombinant human growth hormone (rhGH) on the ability of learning, memory and space exploration of rats with vascular dementia (VD) and to explore its possible mechanism.MethodsForty-five rats were randomly divided into three groups: the experimental group, model group, and normal group, with 15 rats in each. The VD model was prepared in the experimental group and the model group through bilateral carotid artery ligation at different time points (we ligated the right carotid artery three days after the left carotid artery was ligated). The normal group used the same method to separate the bilateral carotid arteries, but we did not ligate the common carotid artery. At the beginning of the first day after modeling, rhGH (0.2 IU/100 g) was injected into the neck of the rats in the experimental group, while rats of the normal group and model group were given the same amount of normal sodium once a day for 28 days. Water maze test was used to assess the ability of learning and memory and space exploration of rats. ELISA was used to detect the levels of vascular endothelial growth factor (VEGF), insulin-like growth factor 1 (IGF-1) and growth hormone (GH) in the serum, cortex, and hippocampus. TUNEL apoptosis staining was used to observe the status of neuronal apoptosis (IOD value).ResultsCompared with the normal group, the experimental group from the first to the fourth day and the model group from the first to the sixth day had longer escape latency (P<0.05). Compared with the model group, the experimental group had shorter escape latency on the 2nd, 4th, 5th, and 6th days (P<0.05). Compared with the model group, the experimental group and the normal group passed the platforms more (P<0.05). Compared with model group, the levels of VEGF, IGF-1, and GH in the serum, cortex, and hippocampus of the experimental group increased (allP<0.05). Compared with the normal group, the levels of VEGF, IGF-1, and GH in the serum, cortex, and hippocampus of the model group decreased (allP<0.05). Compared with the model group, the IOD value of TUNEL apoptosis staining in the hippocampus of the experimental group and the normal group decreased (P<0.05).ConclusionThe rhGH can improve the ability of learning, memory, and space exploration in VD rats by increasing the VEGF and IGF-1 levels in the serum, cortex, and hippocampus.

vascular dementia; recombinant human growth hormone; vascular endothelial growth factor; insulin-like growth factor

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.47.007

R743

A

1002-266X(2017)47-0024-04

四川省教育廳課題(13ZB0266)。

尹加珍(1989-)，女，碩士，藥師，主要研究方向為神經藥理學。E-mail: 422390158@qq.com

黃新武(1972-)，男，碩士，副教授，碩士生導師，主要研究方向為神經藥理學。E-mail: hxw-lgc@163.com

2017-08-08)