潰瘍性結腸炎患者TNF-α基因啟動子-308G/A單核苷酸多態性觀察

常廷民，張超賢，張利利，李秀敏

(新鄉醫學院第一附屬醫院，河南衛輝 453100)

潰瘍性結腸炎患者TNF-α基因啟動子-308G/A單核苷酸多態性觀察

常廷民，張超賢，張利利，李秀敏

(新鄉醫學院第一附屬醫院，河南衛輝 453100)

目的分析潰瘍性結腸炎(UC)患者腫瘤壞死因子-α(TNF-α)基因啟動子-308G/A單核苷酸多態性。方法UC患者750例(觀察組)，健康體檢者750例(對照組)，采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)技術分析兩組TNF-α基因啟動子-308G/A單核苷酸多態性；ELISA法檢測兩組血漿TNF-α。結果觀察組GG、GA、AA基因型頻率及G、A等位基因頻率分別為14.93%、42.27%、42.80%、36.07、63.93%，對照組分別為67.73%、16.40%、15.87%、75.93、24.07%，兩組比較，P均<0.05。觀察組及對照組血漿TNF-α水平分別為(31.48±11.52)、(14.82±5.61)pg/L，兩組比較，P<0.05。觀察組GG、GA、AA基因型攜帶者TNF-α水平分別為(17.95±7.82)、(34.32±0.75)、(34.64±13.83)pg/L，對照組分別為(10.63±3.29)、(21.25±10.47)、(21.91±8.51)pg/L，GA、AA基因型與同組GG基因型攜帶者比較，兩組GG、GA、AA基因型攜帶者比較，P均<0.05。結論UC患者TNF-α基因啟動子-308G/A存在單核苷酸多態性，GA、AA基因型是UC的易患因素，這可能與兩基因型可提高患者血漿TNF-α水平密切相關。

腫瘤壞死因子-α基因啟動子-308G/A；單核苷酸多態性；潰瘍性結腸炎；腫瘤壞死因子α

潰瘍性結腸炎(UC)的病因和發病機制尚未完全明確，目前認為腸道微生態失衡及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)等炎癥細胞因子調節紊亂起重要作用[1～4]。TNF-α是由單核巨噬細胞產生的一種細胞因子，具有廣泛的生物學活性，除有抗腫瘤作用外，對免疫反應、機體代謝、炎癥反應均有重要的調節介導作用[5,6]。TNF-α參與UC致病作用主要是使中性粒細胞聚集、內皮細胞黏附分子表達上調及引起凝血酶原效應等。在腸道中，TNF-α介導黏膜損傷的作用，同時刺激炎癥細胞分泌其他細胞因子，如誘導產生血小板激活因子、白三烯等，使結腸固有膜內小血管在炎癥基礎上形成微血栓，導致黏膜微循環障礙，使腸黏膜組織損傷進一步加重，TNF-α通過上述過程參與UC發病，為UC發病機制中的啟動因子[7,8]。TNF-α基因具有單核苷酸多態性位點，即一個單核苷酸多態性位點具有2個或多個等位基因，不同的等位基因編碼的TNF-α活性有差異[9～12]。TNF-α基因的多態性可使機體對外界環境飲食因素(如高脂飲食)的反應能力有所不同，這是決定機體炎癥性疾病易感性的一個重要因素。本研究對750例UC患者和750例健康體檢者的TNF-α基因啟動子-308G/A單核苷酸多態性進行了觀察，并探討TNF-α基因啟動子-308G/A單核苷酸多態性與UC發病的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2009年4月～2014年8月新鄉醫學院第一附屬醫院收治的UC患者750例(觀察組)，男466，女284例；年齡40～68(50.67±9.14)歲；所有患者均經內鏡檢查結合病理學確診，體檢顯示無腫瘤、其他自身免疫性及遺傳性疾病，納入研究時均為第一次就診，未經任何藥物和手術治療。另選750例健康體檢者作為對照組，男466，女284例；年齡39～69(50.38±8.63)歲。均為豫北居民或在豫北10年及以上，在年齡、性別、民族、籍貫和生活習慣上比較無統計學差異，且無血緣關系。觀察組有飲酒史389例(51.87%)、吸煙史360例(48.00%)，對照組分別為172例(22.93%)、563例(75.07%)，兩組比較，P均<0.05。

1.2 TNF-α基因啟動子-308G/A基因單核苷酸多態性分析 參照文獻[13]方法。于清晨抽取受試者靜脈血8 mL，其中4 mL置于乙二胺四乙酸鈉抗凝管中，分離白細胞層。用QIAampDNA提取試劑盒(德國QIAgen公司)提取白細胞DNA，DNA置于-30 ℃低溫冰箱保存備用。引物序列：5′-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT′，5′-TCCTCCCTGCTGCTCCGATTCCG-3′，由Invitrogen公司合成，PCR反應體系包括：dNTPmix 4 μL(終濃度0.2 mol/L)，10×緩沖液5 μL，MgCl24 μL(終濃度1.5 mol/L)，基因組DNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，Taq DNA聚合酶Mix液(Takara公司)6 μL，使用美國PE-2400型PCR擴增儀。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環；最后72 ℃延伸8 min。PCR產物長度為107 bp，經Bio-Rad染色瓊脂糖凝膠電泳確認擴增結果后，以限制性內切酶NcoⅠ酶切，37 ℃孵育4 h，取酶切產物4 μL經Bio-Rad染色瓊脂糖凝膠電泳。酶切產物放入紫外線凝膠成像儀觀測。可見3種帶型：GG純合子完全被酶切，產生87、20 bp兩種片段，20 bp片段在電泳圖中不能顯示，可見87 bp的1條區帶；GA雜合子部分被酶切，產生為107、87、20 bp的三種片段，20 bp片段不能顯示，在電泳圖中可見為107、87 bp的兩條區帶；AA純合子不能被酶切，顯示107 bp的1條區帶。每組隨機抽取30個初步確定了基因型的樣本，用PCR擴增后，送上海生工生物工程技術服務公司進行DNA序列測定進行驗證。

1.3 血漿TNF-α檢測 采用ELISA法檢測血漿TNF-α。

1.4 統計學方法 采用SPSS11.0統計軟件。Hardy-Weinberg平衡檢驗研究樣本的群體代表性，以P>0.05為符合Hardy-Weinberg規律。用相對風險度的比值比(OR)和95%可信區間(95%CI)評價相對風險，觀察組和對照組之間的基因型頻率和等位基因頻率采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

TNF-α基因啟動子-308G/A的基因型分別為GG、GA、AA，等位基因分別為G、A。符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(P>0.05)，表明本實驗所選取人群具有群體代表性。兩組TNF-α基因啟動子-308G/A基因型、等位基因分布見表1。由表1可知，兩組GG、GA、AA基因型頻率及G、A等位基因頻率比較，P均<0.05。觀察組及對照組血漿TNF-α水平分別為(31.48±11.52)、(14.82±5.61)pg/L，兩組比較，P<0.05。兩組不同基因型攜帶者血漿TNF-α水平比較見表2。

3 討論

表1 兩組TNF-α基因啟動子-308G/A基因型、等位基因分布

表2 兩組不同基因型攜帶者血漿TNF-α水平比較

注：與同組GG基因型攜帶者比較，*P<0.05；與對照組比較，△P<0.05。

TNF-α是一種促炎癥細胞因子，是機體炎癥反應與免疫反應應答的重要調節因子，可使中性粒細胞聚集，產生呼吸爆發、脫顆粒，對淋巴細胞有刺激作用，可上調趨化因子IL-8的表達，IL-8可進一步通過對中性粒細胞的趨化作用，導致腸組織內各種炎癥細胞浸潤[14,15]。此外，TNF-α可增強干擾素-γ誘導的組織相容性復合物表達，協同IFN -γ改變腸道上皮的屏障功能，還可誘導腸上皮細胞凋亡；在IL-6的參與下，誘導凝血酶形成，使小血管在炎癥基礎上形成微血栓，導致黏膜微循環障礙；還可激活磷脂酶，繼而生成白三烯和氧自由基等[16]。大量研究[17,18]表明，TNF-α在UC中呈高表達并在UC中發揮重要的作用。人類TNF-α基因位于第6條染色體短臂Ⅲ類MHC區域，包括4個外顯子和3個內含子，與MHCⅠ類抗原基因的HLA-B相鄰，這個區域的差異能決定某些疾病發生的易感素質。

TNF-α基因的單核苷酸多態性多發生在TNF-α基因的啟動子區內，目前研究較多的是5′端側翼序列的啟動子-308G/A位點多態性。-308G/A位點多態性有三種基因型，即-308G/A(GG)、-308G/A(GA)和-308G/A(AA)，國內外已有研究報道認為-308G/A位點的多態性與多種炎癥性、自身免疫性的易感性有關[19,20]，但機理還不清楚。相關研究顯示，-308G/A處于與轉錄調控的活化子蛋白-2相結合的共同序列中，A等位基因可增強TNF-α轉錄6～7倍，并在基因轉染中能誘導mRNA的表達。啟動子區域G→A的突變使TNF-α基因轉錄、翻譯水平失常，導致TNF-α表達、功能異常[21]，增加了炎癥相關性疾病發生的危險性。本研究顯示，觀察組GG、GA、AA基因型頻率高于對照組，提示攜帶-308G/A(GG)、-308G/A(GA)、-308G/A(AA)基因者患UC的風險高。本文結果顯示，觀察組血漿TNF-α水平高于對照組，提示血漿TNF-α表達和UC的發生密切相關，血漿TNF-α增高可能促進UC的發生發展。本研究還顯示，觀察組和對照組突變基因型攜帶者血漿TNF-α表達水平均明顯高于同一組野生純合子基因型攜帶者，提示-308G/A基因突變可以明顯提高血漿TNF-α表達，這可能是血漿TNF-α表達基因突變促進UC發生發展的重要機制；兩組三個基因型攜帶者血漿TNF-α水平比較均有統計學差異，說明-308G/A基因型雖是影響血漿TNF-α表達的重要因素，但不是惟一因素，還有哪些因素影響血漿TNF-α表達水平值得進一步研究。

總之，UC的發生是涉及多種基因相互作用的復雜過程，本研究提示攜帶TNF-α基因啟動子-308G/A突變基因型的個體屬UC發生高危險人群，UC診治方案中應加以重視，雖然尚不能通過改變其易感基因型來防治UC，但可以通過TNF-α基因啟動子-308G/A基因檢測，預測個體發生UC的風險性，并采取相應的措施如調控基因表達、對可能的危險因素的控制等，以達到有效預防UC的目的。

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SinglenucleotidepolymorphismsofTNF-αgenepromoter-308G/Ainpatientswithulcerativecolitis

CHANGTingmin,ZHANGChaoxian,ZHANGLili,LIXiumin

(TheFirstAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity,Weihui453100,China)

ObjectiveTo analyze the single nucleotide polymorphisms of tumor necrosis factor-α (TNF-α) gene promoter-308G/A in patients with ulcerative colitis (UC).MethodsThe single nucleotide polymorphisms of TNF-α gene promoter-308G/A were analyzed in the peripheral blood leukocytes of 750 patients with confirmed UC (observation group) and 750 healthy persons (control group) by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). The expression of TNF-α in plasma was determined by ELISA.ResultsThe frequencies of GG, GA, AA genotypes and G, A allele in the observation group were 14.93%, 42.27%, 42.80%, 36.07%, and 63.93%, respectively, and 67.73%, 16.40%, 15.87%, 75.93, and 24.07 in the control group, allP<0.05. The levels of TNF-α in the plasma of the observation group and control group were (31.48±11.52) pg/L and (14.82±5.61) pg/L, respectively (P<0.05). The levels of TNF-α in patients with GG, GA and AA genotypes of the observation group were (17.95±7.82), (34.32±0.75), and (34.64±13.83) pg/L, respectively, while those in the control group were (10.63±3.29) and (21.25±10.47), and (21.91±8.51) pg/L, respectively.The differences were significant between patients with GA and AA genotypes and patients with GG genotype in the same group, and between patients with GG, GA and AA genotypes of the two groups (allP<0.05).ConclusionThere is single nucleotide polymorphism of TNF-α gene promoter-308G/A in patients with UC, and GA and AA genotypes are the risk factors for UC, because they can increase the TNF-α expression in plasma.

tumor necrosis factor-α gene promoter-308G/A; single nucleotide polymorphism; ulcerative colitis; tumor necrosis factor-α

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.47.006

R574.62

A

1002-266X(2017)47-0020-04

河南省科技廳科技攻關計劃(112102310283)。

常廷民(1970-)，男，博士，主任醫師，主要研究方向為炎癥性腸病和消化道腫瘤。E-mail: ctminmail@163.com

李秀敏(1964-)，女，博士，主任醫師，主要研究方向為炎癥性腸病和消化道腫瘤。E-mail: lxm3029981@126.com

2017-07-15)

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