替莫唑胺對人腦膠質(zhì)瘤細胞U251增殖、凋亡的影響及其機制探討

張永森，楊利敏，楊衛(wèi)瀧，呂林亞，王玉峰

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院，河南新鄉(xiāng) 453003；2新鄉(xiāng)醫(yī)學院藥學院)

替莫唑胺對人腦膠質(zhì)瘤細胞U251增殖、凋亡的影響及其機制探討

張永森1，楊利敏2，楊衛(wèi)瀧1，呂林亞1，王玉峰1

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院，河南新鄉(xiāng) 453003；2新鄉(xiāng)醫(yī)學院藥學院)

目的觀察替莫唑胺對人腦膠質(zhì)瘤細胞U251增殖、凋亡的影響，并探討其可能機制。方法取對數(shù)生長期U251細胞，分別加入0.02、0.06、0.1 g/L替莫唑胺，空白對照組不加替莫唑胺，分別培養(yǎng)24、48、72 h，MTT實驗觀察細胞增殖情況；取對數(shù)生長期U251細胞，加入0.06 g/L替莫唑胺(0.06 g/L替莫唑胺組)，細胞培養(yǎng)48 h 后，用流式細胞技術(shù)測算細胞凋亡率，RT-PCR法、Western blotting法檢測存活素(Survivin)mRNA、蛋白。結(jié)果隨著替莫唑胺濃度增加及作用時間延長，U251細胞增殖抑制率越高。0.06 g/L替莫唑胺組細胞凋亡率為22.6%±2.3%，對照組為3.3%±1.1%，兩組比較，P<0.05；0.06 g/L替莫唑胺組Survivin mRNA相對表達量為0.65±0.11，對照組為0.96±0.15，兩組比較，P<0.05；0.06 g/L替莫唑胺組Survivin蛋白相對表達量為0.25±0.03，對照組為0.49±0.04，兩組比較，P<0.05。結(jié)論替莫唑胺能有效抑制U251細胞增殖，誘導細胞凋亡，其機制可能與抑制Survivin表達有關(guān)。

替莫唑胺；人腦膠質(zhì)瘤細胞U251；細胞增殖；細胞凋亡；存活素

腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的主要類型之一[1]，惡性程度極高。目前，臨床外科手術(shù)無法有效抑制腦膠質(zhì)瘤細胞的增殖[2]，而且多數(shù)腦膠質(zhì)瘤對放化療不敏感。文獻[3～5]表明，三維適形放療聯(lián)合替莫唑胺能提高腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后總體生存時間及無進展生存時間。替莫唑胺是一種口服烷化劑抗腫瘤藥，能夠通過失活O6-甲基鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶使DNA無法正常進行配對從而殺傷膠質(zhì)瘤細胞[6,7]。存活素(Survivin)是凋亡抑制蛋白IAP家族中的一個蛋白[8]，被認為是腫瘤特異性凋亡抑制因子。本研究觀察了替莫唑胺對人腦膠質(zhì)瘤U251細胞增殖、凋亡的影響，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 藥品、細胞及試劑 替莫唑胺由江蘇天士力帝益藥業(yè)有限公司提供。U251細胞由上海晶抗U251細胞專業(yè)研發(fā)公司提供。DMEM高糖培養(yǎng)基、特級胎牛血清購自上海詩溪化工科技有限公司，Annexin V-PE/7-AAD凋亡試劑盒購自上海研謹生物科技有限公司，RNA裂解液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA聚合酶及擴增引物、兔抗人Survivin單克隆抗體分別由TaKaRa公司、美國Abgent公司提供。

1.2 細胞培養(yǎng) 將U251細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基(100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素)[9]。培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2、飽和濕度。倒置顯微鏡下監(jiān)測細胞生長，當生長至鋪滿瓶底的70%～80%時，加入0.25%胰蛋白酶消化后進行傳代，在液氮條件下凍存。選擇對數(shù)生長期的細胞用于以下實驗。

1.3 細胞增殖抑制率測算 取對數(shù)生長期U251細胞，以0.25%的胰酶消化，以1 000 r/min離心5 min，傾去消化液，接種于96孔板(5×104個/mL)，每個孔加入100 μL培養(yǎng)液制成細胞懸液，后補充培養(yǎng)液至每孔體積達200 μL，放至孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后當觀察到細胞貼壁時倒掉舊培養(yǎng)液，并加入0.02、0.06、0.1 g/L替莫唑胺(實驗組)。加入藥物后分別于不同時間(24、48、72 h)停止培養(yǎng)，加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)。另設(shè)對照組(不加入藥物)。然后進行MTT比色試驗[5]，492 nm波長檢測每孔吸光度值(OD492)。細胞增殖抑制率(%)=(1-實驗組OD492平均值/對照組OD492平均值)×100%。

1.4 細胞凋亡率測算 將U251細胞接種于6孔板中(5×105個/mL)，加入0.06 g/L替莫唑胺處理(0.06 g/L替莫唑胺組)，48 h后收集細胞，另設(shè)對照組(不加入藥物)。細胞離心后加入冷磷酸緩沖鹽溶液使細胞懸浮，再次離心，將所得細胞重懸于200 μL的結(jié)合緩沖液中，加入1 μL Annexin V-PE和5 μL 7-ADD于細胞懸液中混勻[5]，室溫閉光10 min，加入300 μL結(jié)合緩沖液。采用流式分析軟件cellquest 計算細胞凋亡率。

1.5 細胞Survivin mRNA檢測 采用RT-PCR法。用0.06 g/L替莫唑胺處理U251細胞(0.06 g/L替莫唑胺組)，48 h后收集細胞，另設(shè)對照組(不加入藥物)。TRIzol法提取細胞總RNA并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。擴增引物：Survivin：5′-TTCAATCCATCAAAGCTACTACA-3′，Reverse：5′-CAGAGAAAGTTGAACTCTGTTGGATTC-3′，481 bp；β-actin：5′-CGCTGCGCTGGTCGTCGACA-3′，5′-GTCACGCACGATTTC-CCGCT-3′，370 bp。擴增條件[10]：先在95 ℃ 預變性5 min，后在該溫度基礎(chǔ)上依次下調(diào)37、17 ℃(即58、72 ℃)，分別加熱30～45 s，即95、58、72 ℃下分別加熱30、30、45 s，共進行循環(huán)30次，最后在72 ℃下延伸10 min。采用PCR儀自動程序，運用2-ΔΔCt法計算基因的表達水平。

1.6 細胞Survivin蛋白檢測 采用Western blotting法。用0.06 g/L替莫唑胺處理U251細胞(0.06 g/L替莫唑胺組)，48 h后收集細胞，另設(shè)對照組(不加入藥物)。采用RIPA細胞裂解液裂解細胞，提取出總蛋白后應用蛋白定量BCA法測蛋白濃度。取其中35 μg蛋白樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。以聚偏氟乙烯膜轉(zhuǎn)膜，待封閉后加入1∶1 000的Survivin抗體，在4 ℃下留置一夜。次日加入辣根過氧化物酶標記的二抗并在37 ℃下孵育1 h，后采用ECL化學發(fā)光劑顯影[6]，以內(nèi)參為β-actin，將目的蛋白與內(nèi)參比值作為目的蛋白表達相對水平。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時間細胞增殖抑制率比較 結(jié)果見表1。由表1可知，隨著替莫唑胺濃度增加及作用時間延長，U251細胞增殖抑制率越高。

表1 不同時間實驗組細胞增殖抑制率比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.2 兩組細胞凋亡率比較 0.06 g/L替莫唑胺組細胞凋亡率為22.6%±2.3%，對照組為3.3%±1.1%，兩組比較，P<0.05。

2.3 兩組細胞Survivin mRNA相對表達量比較 0.06 g/L替莫唑胺組Survivin mRNA相對表達量為0.65±0.11，對照組為0.96±0.15，兩組比較，P<0.05。

2.4 兩組細胞Survivin蛋白相對表達量比較 0.06 g/L替莫唑胺組Survivin蛋白相對表達量為0.25±0.03，對照組為0.49±0.04，兩組比較，P<0.05。

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是常見的顱內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤[11]。目前，手術(shù)是挽救神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者生命及延長其生存期的主要方式，但因該腫瘤惡性程度高，呈現(xiàn)浸潤生長，常規(guī)手術(shù)不能起到徹底清除病灶的作用，因此化療在延長膠質(zhì)瘤等[12]惡性腫瘤患者生存期方面發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn),腫瘤內(nèi)的無血管區(qū)域能夠阻止藥物滲透到腫瘤的中心部位。

替莫唑胺是一種含有咪唑四嗪環(huán)的烷化劑類抗腫瘤前體藥物[13]。替莫唑胺口服后可快速吸收，不需要經(jīng)過肝臟代謝，生物利用度接近100%，此外其在血腦屏障中穿透力強，便于在顱內(nèi)發(fā)揮細胞毒作用。文獻[14]報道，替莫唑胺可以用于治療成人頑固性多形性成膠質(zhì)細胞瘤。本研究顯示，替莫唑胺能有效抑制U251細胞增殖，并且莫唑胺濃度(40～80 μmol/L )越高，作用時間越長(24～72 h)，U251細胞存活率越低。在腦膠質(zhì)瘤等[15]惡性腫瘤的發(fā)病過程中，幾乎都存在細胞凋亡異常。文獻[16]表明，替莫唑胺能有效降低U251細胞及其干細胞中l(wèi)ivin基因的表達，并促進細胞凋亡。本實驗觀察了替莫唑胺對U251細胞凋亡的影響，結(jié)果顯示U251細胞經(jīng)替莫唑胺干預后出現(xiàn)凋亡，且凋亡率明顯高于對照組。證實替莫唑胺可以誘導U251細胞凋亡。

多數(shù)研究[17,18]認為，凋亡抑制基因和凋亡活化基因之間的平衡是導致細胞凋亡異常被打破的主要原因。Survivin是迄今為止發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制因子中最強效因子[19]，其表達產(chǎn)物Survivin為IAP家族新成員，Survivin C′端富含獨特的疏水基團，形成的卷曲螺旋后有利于Survivin和紡錘體微管的微管蛋白結(jié)合，進而發(fā)揮抑制細胞凋亡和調(diào)節(jié)有絲分裂的雙重作用，在包括腦膠質(zhì)瘤[20]在內(nèi)的絕大多數(shù)腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義。本文結(jié)果顯示，替莫唑胺組Survivinm RNA、蛋白相對表達量均低于對照組。提示替莫唑胺可能通過抑制Survivin的表達起到抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡的作用。

總之，替莫唑胺能夠有效抑制U251細胞增殖，誘導U251細胞凋亡，這可能與抑制Survivin表達有關(guān)。

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EffectsoftemozolomideonproliferationandapoptosisofhumangliomacellsU251

ZHANGYongsen1,YANGLimin,YANGWeilong,LYULinya,WANGYufeng

(1TheThirdAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China)

ObjectiveTo observe the effects of temozolomide on the proliferation and apoptosis of human glioma cells U251 and to explore its possible mechanism.MethodsU251 cells in the logarithmic growth phase were selected and then were added with 0.02、0.06、0.1 g/L temozolomide, but the cells in the blank control group were not given. These cells were cultured for 24, 48 and 72 h, respectively. MTT was applied to observe the cell proliferation. U251 cells in the logarithmic growth phase were selected, and then were added with 0.06 g/L temozolomide (as the 0.06 g/L temozolomide group). After U251 cells were cultured for 48 h with different concentrations of temozolomide, flow cytometry was used to determine the apoptosis rate, and RT-PCR and Western blotting were used to detect the expression level of survivin mRNA.ResultsThe cellular proliferation inhibition rate of U251 cells increased over the time and the increased concentrations of temozolomide. The apoptosis rates of the 0.06 g/L temozolomide group and the control group were 22.6%±2.3% and 3.3%±1.1%, respectively; the relative expression of survivin mRNA was 0.65±0.11 in the 0.06 g/L temozolomide group, and was 0.96±0.15 in the control group; the expression of survivin protein was 0.25±0.03 in the 0.06 g/L temozolomide group, and was 0.49±0.04 in the control group; the differences were significant between these two groups, allP<0.05.ConclusionTemozolomide can effectively inhibit the proliferation of U251 cells and induce the apoptosis by inhibiting the survivin expression.

temozolomide; human glioma cells U251; cell proliferation; apoptosis; survivin

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.47.005

R651.1

A

1002-266X(2017)47-0017-03

張永森(1981-)，男，學士，主治醫(yī)師，主要研究方向為腦血管病及顱底。E-mail: hnzhangyongsen@126.com

2017-08-30)