生長抑素與吉西他濱聯合應用對人轉移性胰腺癌細胞株AsPC-1增殖的影響

劉力，饒奇碩，雷昌斌，王文婷，彭釗，曠星星，劉國文

(1湘南學院附屬醫院，湖南郴州 423000；2南華大學附屬第二醫院；3南華大學病原生物學研究所)

生長抑素與吉西他濱聯合應用對人轉移性胰腺癌細胞株AsPC-1增殖的影響

劉力1，饒奇碩2，雷昌斌1，王文婷1，彭釗1，曠星星3，劉國文2

(1湘南學院附屬醫院，湖南郴州 423000；2南華大學附屬第二醫院；3南華大學病原生物學研究所)

目的觀察生長抑素(SST)與吉西他濱(Gem)聯合應用對人轉移性胰腺癌細胞AsPC-1增殖的影響。方法體外培養AsPC-1細胞。①采用0、100、200、400、600、800 μg/mL SST處理24、48、72 h，計算SST的半數抑制濃度(IC50)；②采用0、0.1、1、5、10、20、40、60 μmol/L Gem處理48 h(按照SST IC50時間)，計算出Gem IC50；③依據以上實驗得出的SST、Gem IC50，將AsPC-1細胞分為4組，A組不做任何處理，B組加入SST IC50，C組加入Gem IC50，D組加入1/2 SST IC50+1/2 Gem IC50，處理時間按SST IC50時間進行，計算各組細胞增殖抑制率。結果AsPC-1細胞在SST濃度為600 μg/mL處理48 h時達到半數抑制。AsPC-1細胞在Gem濃度為20 μmol/L時達到半數抑制。A、B、C、D組細胞增殖抑制率分別為0.00%±3.79%、52.59%±4.57%、48.11%±10.93%、64.86%±4.83%，B、C、D組分別與A組比較，B、C組分別與D組比較，P均<0.05。結論SST聯合Gem可抑制AsPC-1細胞的增殖。

生長抑素；吉西他濱；轉移性胰腺癌細胞AsPC-1

胰腺癌是一種惡性程度高、治療難度大的消化道惡性腫瘤，具有高度侵襲傾向，80%以上的患者會發生局部蔓延和淋巴結轉移，預后極差[1]。文獻[2,3]報道，胰腺癌預后差的主要原因為早期極易發生侵襲轉移及對吉西他濱(Gem)一線化療藥物存在一定的耐藥性。因考慮到研發新型高效的抗腫瘤藥物難度大，故采用現有藥物提高轉移性胰腺癌患者化療效果是目前研究人員的主要研究方向。近年研究[4]發現，生長抑素(SST)具有抗腫瘤作用，其中就包括對肝癌等的增殖抑制作用。人胰腺癌細胞株AsPC-1源自于轉移性胰腺癌細胞，SST對AsPC-1細胞的增殖是否有影響國內外鮮有報道。本研究觀察了SST聯合Gem對AsPC-1細胞增殖的影響，旨在為臨床尋找治療轉移性胰腺癌更有效的化療方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥物及試劑 AsPC-1細胞(中國科學院細胞庫)，注射用SST(揚子江集團藥業有限公司)，Gem(揚子江集團藥業有限公司)，四氮甲唑蘭(MTT，MP Biomedicals公司)，DMEM培養基、胰蛋白酶(美國Sigma公司)，胎牛血清(美國Hyclone公司)。

1.2 AsPC-1細胞培養 AsPC-1細胞培養在DMEM完全培養基中，培養基包含體積分數10%胎牛血清、50 μL/mL青霉素和100 μL/mL鏈霉素雙抗。細胞置于37 ℃、體積分數5%CO2培養箱中，待生長良好后，取對數生長期的AsPC-1細胞，胰酶消化后制成細胞懸液；利用細胞計數板將細胞密度調整約為5×104細胞/mL，按照每孔約5 000細胞數接種于96孔板中；37℃、5%CO2條件下培養24 h后細胞貼壁。取細胞分別進行以下實驗。

1.3 SST對AsPC-1細胞增殖的影響觀察 將AsPC-1細胞分別加入濃度為0、100、200、400、600、800 μg/mL的SST以加入0 μg/mL SST的細胞為對照組，其余濃度為實驗組，處理24、48、72 h；每種濃度各為5復孔。平行培養以上時間后小心吸去孔內反應液，無菌PBS洗去殘留液2次，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL及相應培養液至100 μL，于培養箱中繼續培養4 h；小心吸干每孔MTT的培養液，每孔加入150 μL DMSO，室溫搖床上震蕩5～10 min，用酶標儀在490 nm波長處檢測各孔的吸光度值(OD值)，細胞增殖抑制率=(1-實驗組OD值)/對照組OD值。由以上結果計算出SST半數抑制濃度(IC50)。

1.4 Gem對AsPC-1細胞增殖的影響觀察 將AsPC-1細胞分別加入0、0.1、1、5、10、20、40、60 μmol/L的Gem，處理時間按1.3中SST IC50時間進行；每種濃度各為5復孔。平行培養以上時間后小心吸去孔內反應液，無菌PBS洗去殘留液2次，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL及相應培養液至100 μL，于培養箱中繼續培養4 h；小心吸干每孔MTT的培養液，每孔加入150 μL DMSO，室溫搖床上震蕩5～10 min，用酶標儀在490 nm波長處檢測各孔的OD值，細胞增殖抑制率=(1-實驗組OD值)/對照組OD值；由以上結果計算出Gem IC50。

1.5 SST聯合Gem對AsPC-1細胞增殖的影響觀察 根據1.3和1.4實驗得出的SST、Gem IC50，將細胞進行分組，A組不做任何處理，B組加入SST IC50，C組加入Gem IC50，D組加入1/2 SST IC50+1/2 Gem IC50，處理時間按SST IC50時間進行。每種濃度各為5復孔。平行培養以上時間后小心吸去孔內反應液，無菌PBS洗去殘留液2次，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL及相應培養液至100 μL，于培養箱中繼續培養4 h。小心吸干每孔MTT的培養液，每孔加入150 μL DMSO，室溫搖床上震蕩5～10 min，用酶標儀在490 nm波長處檢測各孔的OD值，細胞增殖抑制率=(1-實驗組OD值)/對照組OD值。按公式計算兩藥相互作用：q=兩藥聯合抑制率/兩藥單用抑制率之和-兩藥單用抑制率之積。q<0.85，兩藥拮抗作用；0.85≤q≤1.15，兩藥相加作用；q>1.15，兩藥協同作用。

2 結果

2.1 不同濃度SST作用于AsPC-1細胞增殖抑制率比較 結果見表1。由表1可知，AsPC-1細胞在SST濃度為600 μg/mL處理48 h后，達到半數抑制。

表1 不同濃度SST作用于AsPC-1細胞增殖抑制率比較

注：與0 μg/mL SST比較，★P<0.05；與上一濃度比較，☆P<0.05。

2.2 不同濃度Gem作用于AsPC-1細胞增殖抑制率比較 0、0.1、1、5、10、20、40、60作用于AsPC-1細胞增殖抑制率分別為0.00%±2.49%、28.33%±5.88%、32.53%±7.41%、37.58%±7.20%、44.09%±7.36%、49.72%±6.18%、83.50%±0.36%、87.88%±5.89%，其余各濃度組與0 μmol/L的Gem組比較,P均<0.05；20、40 μmol/L Gem組比較，P均<0.05。由以上結果可知，AsPC-1細胞在Gem濃度為20 μmol/L時達到半數抑制。

2.3 SST聯合Gem作用于AsPC-1細胞增殖抑制率比較 A、B、C、D組細胞增殖抑制率分別為0.00%±3.79%、52.59%±4.57%、48.11%±10.93%、64.86%±4.83%，B、C、D組分別與A組比較，B、C組分別與D組比較，P均<0.05。經公式計算，兩藥相互作用q=0.87，表明聯合用藥具有相加作用。

3 討論

胰腺癌是惡性程度、致死率極高的消化系腫瘤，被稱為“癌中之王”[5]。由于胰腺癌在早期無明顯癥狀、體征，并且缺乏有效的早期篩查和診斷方法，80%以上患者就診時已伴有淋巴結或遠處轉移，喪失手術切除機會，并且轉移性胰腺癌5年生存率<5%[6]。盡管過去的數十年內，研究者對胰腺癌的治療提出了很多新的方法，但是外科手術治療聯合化療仍是目前治療胰腺癌的最佳方式，但這僅能使20%的患者獲益[7]。據統計，約有超過40%的胰腺癌患者雖無遠處轉移，但伴有廣泛的血管及淋巴結侵犯，而不能接受及時的手術治療[8]。故化療仍是轉移性胰腺癌或胰腺癌晚期患者首選。胰腺癌預后差的主要原因是早期極易發生侵襲轉移[9]，且胰腺癌細胞對一線化療藥Gem存在耐藥性，是最終導致治療失敗的關鍵所在[10,11]。

Gem是治療轉移性胰腺癌的最佳一線化療藥物，但由于它在細胞內的代謝過程復雜，有多種相關蛋白和因子的參與，極易產生耐藥性[12,13]。由于化療耐藥性的存在，現如今提倡聯合用藥對轉移性胰腺癌進行更有效的化療，并且取得了顯著效果。最新NCCN胰腺癌治療指南提出了一些新的聯合化療方案[14]：①遠處轉移的胰腺癌：Gem聯合白蛋白結合型紫杉醇方案被列為推薦方案；②新輔助治療方案：Gem聯合白蛋白結合型紫杉醇方案；③復發性胰腺癌治療方案：Gem聯合白蛋白結合型紫杉醇方案等。故如今尋找有效的聯合化療方案有重要的意義。SST是從羊和豬的下丘腦提取液中分離和鑒定的一種生長激素釋放抑制激素，能強烈抑制垂體分泌生長激素，常用于胰腺手術后、急性胰腺炎、胃泌素瘤、胰島素瘤等的治療。近期研究發現，SST及其類似物具有多種抗腫瘤作用，主要表現為直接與受體結合激活cAMP途徑、蛋白磷酸酶途徑等抑制腫瘤增殖[15]，或間接抑制促腫瘤生長的激素或細胞因子的釋放、腫瘤血管生成等[16]。Berindan-Neagoe等[17]發現，高濃度SST對胰腺癌細胞具有抑制作用，并與濃度呈依賴關系，而且對凋亡亦有促進作用。同時SST類似物對轉染SST2R的胰腺癌細胞可下調Survivin的表達量[18]，可增強SST對胰腺癌細胞株的殺傷力[19]。并且有研究報道[20，21]，SST與腫瘤化療藥物具有協同效應，能夠增強多種消化道腫瘤對化療藥物的敏感性，以致增加療效。但目前國內外鮮有關于SST與Gem聯合用藥治療轉移性胰腺癌細胞的研究，故本實驗中選取SST作為研究對象，觀察其是否能夠協同Gem抑制胰腺癌細胞的增殖作用。

本研究顯示，A、B、C、D組細胞增殖抑制率分別為0.00%±3.79%、52.59%±4.57%、48.11%±10.93%、64.86%±4.83%，B、C、D組分別與A組比較，B、C組分別與D組比較，P均<0.05。提示SST和Gem均能抑制胰腺癌AsPC-1細胞增殖，但SST與Gem聯用抑制率明顯大于單藥。表明聯合用藥具有相加作用，能有效地提高Gem化療效果。

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EffectofsomatostatincombinedwithgemcitabineonproliferationofhumanmetastaticpancreaticcancercelllineAsPC-1

LIULi1,RAOQisuo,LEIChangbin,WANGWenting,PENGZhao,KUANGXingxing,LIUGuowen

(1AffiliatedHospitalofXiangnanUniversity,Chenzhou423000,China)

ObjectiveTo observe the effect of combined therapy with somatostatin (SST) and gemcitabine (Gem) on the proliferation of human metastatic pancreatic cancer AsPC-1 cells.MethodsThe AsPC-1 cells were cultured in vitro. ① The cells were treated with 0, 100, 200, 400, 600, and 800 μg/mL SST for 24, 48, and 72 h, then we calculated the IC50of SST. ② The cells were treated with 0, 0.1, 1 5, 10, 20, 40, and 60 μmol/L Gem for 48 h, and we calculated the IC50of Gem. After that, AsPC-1 cells were divided into four groups: an untreated control group (group A), a group treated with SST at IC50(group B), a group treated with Gem at IC50(group C), and a group treated with SST+Gem at half of their IC50(group D). At 48 h after treatment, the inhibition rates were calculated.ResultsFor AsPC-1 cells, IC50of SST was 600 μg/mL at 48 h, and IC50of Gem was 20 μmol/L. The inhibition rates in the groups A, B, C and D were 0.00%±3.79%, 52.59%±4.57%, 48.11%±10.93%, and 64.86%±4.83%, respectively. The cell growth was significantly inhibited in the groups B, C, and D as compared with that of group A (P<0.05), and the inhibition rate was significantly higher in the group D than in the groups B and C (P<0.05).ConclusionThe combination of SST and Gem can inhibit the growth of AsPC-1 cells.

somatostatin; gemcitabine; metastatic pancreatic cancer cells AsPC-1

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.47.003

R735

A

1002-266X(2017)47-0009-04

湖南省教育廳資助科研項目(16C1487)。

劉力(1983-)，男，碩士，主治醫師，主要研究方向為肝膽胰腫瘤的防治。E-mail: 276016958@qq.com

劉國文(1969-)，男，博士，碩士生導師，教授，主要研究方向為普外腫瘤的防治。E-mail： lgw8318@yahoo.com.cn

2017-08-29)

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