葛黃顆粒含藥血清對乙醇損傷的人肝細胞L-02保護作用觀察及其機制探討

仁德芳，陳柚伶，郎涵，付裕，王洪連，魏嵋，王曉棟，李志

(1西南醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，四川瀘州 646000；2西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院)

·論著·

葛黃顆粒含藥血清對乙醇損傷的人肝細胞L-02保護作用觀察及其機制探討

仁德芳1,2，陳柚伶1,2，郎涵1,2，付裕1,2，王洪連2，魏嵋2，王曉棟2，李志2

(1西南醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，四川瀘州 646000；2西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院)

目的觀察葛黃顆粒含藥血清對乙醇損傷的人肝細胞L-02修復(fù)作用, 并探討其可能機制。方法①將L-02細胞分為A、B、C、D、E、F組。除F組外，其余各組均加入乙醇培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h制備肝細胞損傷模型，造模后吸走培養(yǎng)液。D、F組加入空白血清(10%正常大鼠血清)，A組加入1.25%葛黃顆粒含藥血清+8.75%正常大鼠血清，B組加入2.5%葛黃顆粒含藥血清+7.5%正常大鼠血清，C組加入5%葛黃顆粒含藥血清+5%正常大鼠血清，E組加入5%美他多辛含藥血清+5%正常大鼠血清，繼續(xù)培養(yǎng)6、12、24 h。比較各組細胞上清液谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)活力。②將L-02細胞按2×104個/孔接種于6孔板中，將其分為a、b、c、d組。除d組外，其余各組均加入乙醇制備肝細胞損傷模型，造模后吸走培養(yǎng)液。b、d組加入空白血清，a組加入5%葛黃顆粒含藥血清，c組加入5%美他多辛含藥血清，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。比較各組丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)、細胞活性氧(ROS)、線粒體膜電位(MMP)、三磷酸腺苷(ATP)。結(jié)果與F組比較，D組各時點AST、LDH升高；與D組比較，B組24 h AST、LDH降低，C、E組12 h和24 h的AST、LDH降低；與A組比較，B組24 h AST降低，C組24 h AST及12 h LDH降低，E組12、24 h AST和LDH降低；與B組比較，C、E組12 h AST、LDH降低；與同組6 h比較，C組24 h AST降低，12、24 h LDH降低；與同組12 h比較，B、C、E組24 h AST降低，C組24 h LDH降低；P均<0.05。與d組比較，b組SOD、GSH-px、MMP、ATP降低，MDA、ROS升高(P均<0.05)；與b組比較，a組和c組SOD、GSH-px、MMP、ATP升高，MDA、ROS降低(P均<0.05)。結(jié)論葛黃顆粒含藥血清對乙醇致L-02細胞損傷有一定修復(fù)作用，其機制可能是調(diào)整細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平和線粒體功能。

葛黃顆粒；酒精性肝?。蝗烁渭毎?；L-02細胞；氧化損傷；線粒體功能

酒精性肝病(ALD)是由于長期過量飲酒所致肝臟損害的一系列病變，是酒精及其代謝產(chǎn)物對肝細胞的直接毒性作用導(dǎo)致的結(jié)果。目前，ALD已成為嚴(yán)重危害我國國民健康的一大疾病，其發(fā)病率呈逐年增高趨勢[1]。葛花解酲湯被記載于金元醫(yī)家李東垣《脾胃論》一書中，是用于治療“傷酒”的方劑，可謂解酒名方，具有分消酒濕、健脾理氣之功效；葛黃顆粒是由我院孫同郊教授以此方為基礎(chǔ)并結(jié)合其長期治療ALD的臨床經(jīng)驗總結(jié)的經(jīng)驗方“葛黃解酒方”，具有醒酒解毒、清熱利濕、健脾疏肝之功效，臨床實踐中取得了顯著療效。本課題組前期動物實驗研究顯示，葛黃顆粒可顯著降低ALD大鼠模型血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活力，對ALD有較好的防治作用[2]。本研究觀察了葛黃顆粒含藥血清對乙醇損傷的人肝細胞L-02的影響，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞系 雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(200±20)g，由西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。L-O2細胞，由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究中心提供。

1.2 實驗藥物 葛黃顆粒處方組成：葛花、柴胡、丹參、趕黃草、虎杖、茯苓、白術(shù)、枳椇子、甘草等；制成流浸膏，1 mL流浸膏等同于原生藥2 g，由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室研制供給(批號：20150504)；美他多辛片，由山東齊都藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格0.5 g/片(批號：1402002)。

1.3 主要試劑、儀器 胎牛血清，RPMI1640，青霉素-鏈霉素溶液，活性氧檢測試劑盒，線粒體膜電位檢測試劑盒，AST測試盒，LDH測試盒，SOD測試盒，GSH-px測試盒，MDA測試盒，ATP檢測試劑盒。倒置相差顯微鏡(TS100)，全自動酶標(biāo)儀，二氧化碳細胞培養(yǎng)箱，AU 2700全自動生化分析儀，BIOMATE 3S紫外分光光度計，流式細胞儀。

1.4 主要溶液 完全培養(yǎng)基(890 mL/L RPMI1640、100 mL/L胎牛血清、10 mL/L青霉素-鏈霉素溶液)，乙醇培養(yǎng)基(860 mL/L RPMI1640、100 mL/L胎牛血清、10 mL/L青霉素-鏈霉素溶液、30 mL/L無水乙醇)。

1.5 葛黃顆粒含藥血清制備 取SD大鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，后隨機分為3組各20只，給藥劑量參考《動物與人體的每千克體質(zhì)量劑量折算系數(shù)表》及李儀奎[3]提出的具體給藥劑量公式，即葛黃顆粒組為3.1 g生藥葛黃顆粒/(100 g·d)，美他多辛組為0.1 g美他多辛/(100 g·d)，空白對照組為等體積蒸餾水，各組每日早、晚各灌胃1次，1 mL/(100 g·次)，連續(xù)5 d，末次給藥后1 h后各組分別采血并收集血清，過濾除菌、分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆?注意全程無菌操作)。

1.6 細胞損傷模型制備及葛黃顆粒含藥血清對L-02細胞損傷的影響觀察 取L-02細胞，將其分為A、B、C、D、E、F組。除F組外，其余各組均加入乙醇培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h造模，造模后吸走培養(yǎng)液。D、F組加入空白血清(10%正常大鼠血清)，A組加入1.25%葛黃顆粒含藥血清+8.75%正常大鼠血清，B組加入2.5%葛黃顆粒含藥血清+7.5%正常大鼠血清，C組加入5%葛黃顆粒含藥血清+5%正常大鼠血清，E組加入5%美他多辛含藥血清+5%正常大鼠血清，繼續(xù)培養(yǎng)6、12、24 h。收集細胞上清液，采用全自動生化分析儀檢測細胞上清液AST、LDH活力。

1.7 細胞損傷模型制備及葛黃顆粒含藥血清對L-02細胞損傷影響的作用機制觀察 取L-02細胞，按2×104個/孔接種于6孔板中，將其分為a、b、c、d組。除d組外，其余各組均加入乙醇造模，造模后吸走培養(yǎng)液。b、d組加入空白血清，a組加入5%葛黃顆粒含藥血清，c組加入5%美他多辛含藥血清，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細胞，超聲破碎裂解部分細胞，分別采用硫代巴比妥酸法、黃嘌呤氧化酶法及賴氏法檢測各組細胞內(nèi)丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)活力，部分細胞通過流式細胞儀檢測細胞細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平，JC-1法檢測細胞內(nèi)線粒體膜電位(MMP)水平，全自動酶標(biāo)儀檢測細胞內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞上清液AST、LDH活力比較 結(jié)果見表1。

表1 各組細胞上清液AST、LDH活力比較

注：與F組比較，aP<0.05；與D組比較，bP<0.05；與A組比較，cP<0.05；與B組比較，dP<0.05；與同組6 h比較，eP<0.05；與同組12 h比較，fP<0.05。

2.2 各組細胞SOD、GSH-px活力及MDA、ATP含量和ROS、MMP水平比較 結(jié)果見表2。

表2 各組細胞SOD、GSH-px活力及MDA、ATP含量和ROS、MMP水平比較

注：與d組比較，aP<0.05；與b組比較，bP<0.05。

3 討論

葛黃顆粒主要包含葛花、柴胡、丹參、趕黃草、虎杖、茯苓、甘草等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，葛花中富含大量的黃酮類和皂苷類化合物，具有很強的抗氧化作用，能有效清除體內(nèi)自由基，促進人體正常的新陳代謝，其促進酒精代謝及護肝作用與這些物質(zhì)密切相關(guān)[4]。槲皮素是趕黃草主要有效成分之一，具有較強的抗氧化、清除氧自由基、降糖、降脂及降壓的作用[5～7]。柴胡皂苷是中藥柴胡中提取出的有效成分，能增強機體抗氧化防御能力，從而抑制自由基的產(chǎn)生，達到穩(wěn)定肝細胞膜系統(tǒng)，促進肝細胞生長，防止肝細胞損傷和壞死[8]?；⒄鹊闹饕钚猿煞职邹继J醇是一種天然抗氧化劑，同時還具有抗炎癥、抗過敏、調(diào)節(jié)免疫等藥理活性[9]。上述研究均提示葛黃解酒方的保肝作用可能與抗氧化有關(guān)。

AST、ALT、LDH主要存在于肝細胞的胞質(zhì)和線粒體，當(dāng)肝細胞受損時，肝細胞膜破壞、通透性增加，AST、ALT、LDH從細胞內(nèi)大量泄漏，故AST、ALT、LDH能反映肝細胞損傷程度。同時，AST、ALT是ALD診斷的重要臨床指標(biāo)[10]。

ALD存在多種發(fā)病機制，如乙醇氧化的代謝效應(yīng)、機體的氧化應(yīng)激狀態(tài)、乙醇及其代謝產(chǎn)物乙醛的自身毒性、免疫與炎癥反應(yīng)相關(guān)機制凋亡等[11～14]。乙醇在肝細胞分解代謝，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量氧自由基，消耗體內(nèi)抗氧化劑(SOD、GSH-px)，氧自由基的產(chǎn)生不能被抗氧化劑及時清除，氧化-抗氧化系統(tǒng)失去原有平衡，肝細胞內(nèi)活性氧ROS的蓄積逐漸增多，造成氧化應(yīng)激損傷。乙醇在氧化過程中產(chǎn)生的氧自由基，特別是羥自由基將破壞細胞和細胞器生物膜中的不飽和脂肪酸，誘發(fā)脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物MDA，造成多個細胞器功能障礙。當(dāng)線粒體膜受到損傷后，線粒體膜電位去極化，質(zhì)子從非特異性部位滲漏回基質(zhì)，氧化磷酸化反應(yīng)出現(xiàn)障礙，導(dǎo)致ATP的合成障礙，影響細胞能量代謝[15]，導(dǎo)致細胞損傷和凋亡。其中MDA作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，反映氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細胞膜損傷程度[16～18]?？傊?，乙醇誘導(dǎo)L-02細胞線粒體發(fā)生氧化應(yīng)激時，產(chǎn)生大量的ROS，消耗體內(nèi)抗氧化劑(SOD、GSH-px)，誘發(fā)生物膜脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物MDA，損傷生物膜，引起線粒體功能障礙，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，從而使ATP生成減少，出現(xiàn)能量代謝障礙，同時又進一步加重ROS的蓄積，形成惡性循環(huán)[19,20]。因此，減輕ROS的蓄積、提高機體抗氧化水平、減少生物膜脂質(zhì)過氧化、維持線粒體的膜電位水平是避免肝細胞內(nèi)發(fā)生能量代謝障礙、減輕肝細胞的損傷、抑制肝細胞凋亡的重要途徑。

本研究顯示，與F組比較，D組各時點AST、LDH升高；與D組比較，B組24 h AST、LDH降低，C、E組12 h和24 h的AST、LDH降低；與A組比較，B組24 h AST降低，C組24 h AST及12 h LDH降低，E組12、24 h AST和LDH降低；與B組比較，C、E組12 h AST、LDH降低；與同組6 h比較，C組24 h AST降低，12、24 h LDH降低；與同組12 h比較，B、C、E組24 h AST降低，C組24 h LDH降低。與d組比較，b組SOD、GSH-px、MMP、ATP降低，MDA、ROS升高(P均<0.05)；與b組比較，a組和c組SOD、GSH-px、MMP、ATP升高，MDA、ROS降低。說明葛黃顆粒含藥血清對乙醇誘導(dǎo)的L-02細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)具有明顯的拮抗作用，能夠降低細胞ROS的產(chǎn)生，提高肝細胞中抗氧化酶活性，抑制脂質(zhì)過氧化、保護生物膜，維持線粒體膜電位水平，促進細胞內(nèi)ATP合成，減輕細胞內(nèi)能量代謝障礙，改善線粒體的功能，從而有效減輕乙醇誘導(dǎo)的L-02細胞氧化應(yīng)激損傷，是防治ALD的有效途徑之一。

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ProtectiveeffectofGehuanggranulemedicatedserumonethanol-inducedinjuryofhumanhepatocytesL-02

RENDefang1,CHENYouling,LANGHan,FUYu,WANGHonglian,WEIMei,WANGXiaodong,LIZhi

(1IntegratedChineseandWesternMedicineCollegeofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China)

ObjectiveTo observe the effects of different dosages of Gehuang granule medicated serum (GHG) on the ethanol-induced injury of human hepatocytes L-02 and to explore its possible mechanism.Methods① L-02 cells were divided into groups A, B, C, D, E, and F. Except the group F, the other groups were cultured in ethanol for 24 h, and the medium was taken away after the model was established. The groups D and F were added with the blank serum (10% normal rat serum), the rest were added with the corresponding drug-containing serum: group A was added with 1.25% GHG+8.75% normal rat serum, group B was added with 2.5% GHG+7.5% normal rat serum, groups C was added with 5% GHG+5% normal rat serum, group E was added with 5% metatoxin medicated serum+5% normal rat serum and then we continued to culture the cells for 6, 12, and 24 h. The activities of aspartate aminotransferase (AST) and lactate dehydrogenase (LDH) in the supernatant of each group were compared. ② The L-02 cells were inoculated into 2×104cells/6-well plate, and then were divided into groups a, b, c, and d. In addition to the group d, the remaining groups were added with the ethanol modeling, after that, the medium was taken away. The groups b and d were added with the blank serum, group a was added with 5% GHG, group c was added with 5% metatoxin medicated serum and then we continued to culture the cells for 24 h. The levels of malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-px), reactive oxygen species (ROS), mitochondrial membrane potential (MMP), and adenosine triphosphate (ATP) were compared.ResultsCompared with group F, AST and LDH increased at each time point in the group D; compared with group D, AST and LDH in the group B decreased at 24 h, AST and LDH decreased at 12 and 24 h in the groups C and E, respectively; compared with group A , 24-hour AST (24 h AST) decreased in the group B, 24 h AST and 12 h LDH decreased in the group C, while AST and LDH decreased at 12 and 24 h in the group E; compared with the group B, AST and LDH decreased at 12 h in the group C and E; compared with the same group at 6 h, the 24 h AST in the group C decreased and the LDH decreased at 12 and 24 h; compared with the same group at 12 h, AST decreased at 24 h in the groups B, C, and E, and the LDH decreased at 24 h, allP<0.05. Compared with the group d, the levels of SOD, GSH-px, MMP, and ATP decreased, and MDA and ROS increased in the serum of group b (allP<0.05). Compared with the group b, the levels of SOD, GSH-px, MMP, and ATP increased, and MDA and ROS decreased in the groups a and c (allP<0.05).ConclusionGHG has a protective effect on ethanol-induced L-02 cell injury by regulating the level of intracellular oxidative stress and protecting mitochondrial function.

Gehuang granules; ethanol; human hepatocytes; L-02 cells; oxidative damage; mitochondrial function

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.47.001

R89；R36；R39

A

1002-266X(2017)47-0001-04

四川省科技廳課題(2013SZ0148)；瀘州市科技局課題(2013LZLY-J24)。

仁德芳(1991-)，女，碩士，住院醫(yī)師，主要研究方向為中西醫(yī)結(jié)合防治消化系統(tǒng)疾病。E-mail： 2426503594@qq.com

李志(1973-)，男，博士，教授，主要研究方向為中西醫(yī)結(jié)合防治消化系統(tǒng)疾病。E-mail： 724232536@qq.com

2017-03-13)