安吉白茶愈傷組織增殖培養(yǎng)及茶多酚的積累

林昱星，肖澤豐，田璧瑞，郝娜，王俊麗

(中央民族大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081)

安吉白茶愈傷組織增殖培養(yǎng)及茶多酚的積累

林昱星，肖澤豐，田璧瑞，郝娜，王俊麗

(中央民族大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081)

為了有效利用安吉白茶資源，以安吉白茶幼葉作為外植體，探討了不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)、增殖及茶多酚積累的影響.研究結(jié)果表明，TDZ有利于愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖及茶多酚的積累，當(dāng)TDZ的質(zhì)量濃度為 1.0 mg/L時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)率為92.1%，茶多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.6%，表兒茶素的相對(duì)含量為5.3%.

安吉白茶；愈傷組織；茶多酚；GC-MS分析

安吉白茶原產(chǎn)于浙江省安吉縣，是茶(Camelliasinensis(L.) O.Ktze.)的一種白化突變類型，春季幼葉呈白色.目前中國(guó)南方多地引種安吉白茶[1-3].

茶多酚是茶樹(shù)中重要的次生代謝產(chǎn)物，其具有多種藥理作用和保健功效.于淑池等[4]研究發(fā)現(xiàn)，安吉白茶所含的茶多酚是一種潛在天然抗氧化劑，可在食品和醫(yī)藥中廣泛應(yīng)用.呂娜等[5]研究表明，安吉白茶含有黃酮類化合物，具有較強(qiáng)的抗氧化活性和清除自由基的作用.夏道宗等[6]研究發(fā)現(xiàn)，安吉白茶中的茶多糖可顯著抑制瘤株S180細(xì)胞和H22腹水型肝癌移植瘤的生長(zhǎng)，可使荷S180實(shí)體瘤小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力顯著提升.Hajiaghaalipour等[7]研究發(fā)現(xiàn)，白茶提取物能有效保護(hù)細(xì)胞系(3T3-L1)DNA免受損傷，并能抑制腫瘤細(xì)胞(HT-29)的增殖.此外，安吉白茶提取液對(duì)黃桿菌的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，這種抑制作用是通過(guò)對(duì)菌體細(xì)胞膜的破壞和對(duì)磷代謝的干擾而實(shí)現(xiàn)的[8].

安吉白茶對(duì)高溫、干旱、低溫凍害、強(qiáng)光照射的耐受能力弱，加之采摘時(shí)間受限、產(chǎn)量較低，在市場(chǎng)中常出現(xiàn)供不應(yīng)求的局面.因此本研究通過(guò)對(duì)安吉白茶的組織培養(yǎng)，探索細(xì)胞生物量快速增長(zhǎng)的適宜條件，促進(jìn)茶多酚的合成與積累，為茶多酚工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與消毒處理

安吉白茶幼葉采自貴州省德江縣平原鄉(xiāng).幼葉先用自來(lái)水沖洗1 h，之后用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇消毒30 s，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的氯化汞溶液消毒8 min，最后用無(wú)菌水漂洗3～5次，備用.

1.2 接種與培養(yǎng)

在潔凈工作臺(tái)中，將無(wú)菌葉片切成0.5 cm×0.5 cm的小塊，進(jìn)行接種培養(yǎng).所用培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，并添加蔗糖(30 g/L)和瓊脂(7 g/L)，pH值調(diào)至5.8左右，在121 ℃條件下滅菌20 min.培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，光照強(qiáng)度為2 500～3 000 lx，光照時(shí)間為12 h/d.

1.3 愈傷組織的誘導(dǎo)

將消毒后的葉片外植體分別接種于含有不同質(zhì)量濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，2,4-D、NAA、6-BA、KT、TDZ的質(zhì)量濃度均為0、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L.每個(gè)處理包含10瓶，每瓶接種5個(gè)葉片外植體，設(shè)置3次重復(fù)，于30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的誘導(dǎo)率.

1.4 愈傷組織增殖培養(yǎng)

選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的愈傷組織切成小塊，接種到不同培養(yǎng)基中，每瓶接種0.8 g(鮮質(zhì)量)，每個(gè)處理包含10瓶，設(shè)置3次重復(fù)，培養(yǎng)45 d后收獲愈傷組織并稱量鮮質(zhì)量和干質(zhì)量.

1.5 茶多酚含量測(cè)定

茶多酚含量測(cè)定方法參照GB/T 8313—2008，采用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定.

1.6 愈傷組織醇提物的制備

準(zhǔn)確稱取10 g磨碎的干愈傷組織或安吉白茶干葉片，加入250 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇，于70 ℃水浴中浸提10 min，重復(fù)浸提1次，合并上清液，抽濾，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，浸膏自然晾干.

1.7 醇提物GC-MS分析

準(zhǔn)確稱取浸膏樣品0.12 g，取200 mL吡啶和100 mL的TMS在75 ℃水浴條件下硅烷化反應(yīng)60 min，離心(8 000 r/min，10 min)，取上層液進(jìn)樣，采用氣質(zhì)聯(lián)用儀(AGILENT 5975/19091Z-433型)進(jìn)行測(cè)定.所用毛細(xì)管柱為HP-35ms(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)，以He氣為載氣，液體流速為 1 mL/min，進(jìn)樣量為1 μL，進(jìn)樣口溫度為280 ℃.電子轟擊(El)源，電壓 70 eV，掃描 20～800 amu，借助質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)NISTOS進(jìn)行成分分析.

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0軟件中的ANOVA (one-way anova statistics)程序，采用Duncan比較法進(jìn)行分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)

研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基分別添加不同質(zhì)量濃度的單一植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(2,4-D、NAA、6-BA、KT、TDZ)時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng)明顯不同(表1).

培養(yǎng)基中附加不同質(zhì)量濃度(0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L)的2,4-D時(shí)，30 d后僅能誘導(dǎo)出少量乳白色愈傷組織.當(dāng)2,4-D質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時(shí)，葉片愈傷組織的誘導(dǎo)率為75.7%，但隨著2,4-D質(zhì)量濃度的升高，誘導(dǎo)率明顯降低.

表1 2,4-D、NAA、6-BA和TDZ對(duì)安吉白茶愈傷組織誘導(dǎo)的影響

培養(yǎng)基附加不同質(zhì)量濃度的NAA時(shí)所誘導(dǎo)出的愈傷組織也為乳白色，且質(zhì)地較硬.當(dāng)NAA的質(zhì)量濃度為1.0～4.0 mg/L時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)率為86.0%～87.0%.將外植體接種于含有不同質(zhì)量濃度6-BA的培養(yǎng)基中，30 d后能誘導(dǎo)出黃綠色的愈傷組織，但誘導(dǎo)率不高，最高值僅為60.6%.

培養(yǎng)基中分別附加不同質(zhì)量濃度(0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L)的TDZ時(shí)，15 d左右就可誘導(dǎo)出疏松的紅色愈傷組織.當(dāng)TDZ質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)率最高，達(dá)92.1%.

然而，當(dāng)MS培養(yǎng)基中附加KT時(shí)，無(wú)論其質(zhì)量濃度高低，均不能誘導(dǎo)出愈傷組織.

2.2 愈傷組織的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)

將愈傷組織切成小塊，接種在MS+TDZ 1.0 mg/L培養(yǎng)基上，每瓶接種0.8 g(鮮質(zhì)量)，每隔5 d取3瓶稱量其鮮質(zhì)量和干質(zhì)量(于50 ℃烘箱中烘干)，重復(fù)3次.細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)如圖1.

a.鮮質(zhì)量，b.干質(zhì)量.圖1 愈傷組織生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)曲線Fig.1 Growth curve of callus

從圖1可以看出，安吉白茶愈傷組織的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量在第11～45 d處于快速增長(zhǎng)期，至第45 d時(shí)生長(zhǎng)量達(dá)到最大值.因此，第45 d是采收愈傷組織的最佳時(shí)間.

2.3 愈傷組織的增殖

將愈傷組織接種到添加不同質(zhì)量濃度的IAA、6-BA和TDZ的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，其增殖效應(yīng)如表2所示.

表2 IAA、6-BA和TDZ對(duì)愈傷組織增殖的影響

從表2中可以看出，IAA和TDZ有利于愈傷組織的增殖.當(dāng)IAA質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時(shí)，愈傷組織的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量到達(dá)最大值，分別為10.7 g和0.83 g，分別增長(zhǎng)了13倍和20倍.當(dāng)培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的TDZ時(shí)，所增殖的愈傷組織大部分呈紅色，質(zhì)地較疏松.當(dāng)TDZ質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時(shí)，愈傷組織的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量達(dá)到最大值，分別為13.3 g和0.81 g，分別增長(zhǎng)了16倍和20倍.

2.4 不同愈傷組織中茶多酚的含量

選取不同愈傷組織測(cè)定茶多酚的含量，以栽培植株葉片為對(duì)照組，其結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 不同愈傷組織中茶多酚含量

從表3可知，MS培養(yǎng)基中附加TDZ 1.0 mg/L時(shí)，愈傷組織中茶多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)20.6%，是栽培植株的葉片茶多酚含量的1.6倍，因此MS+TDZ 1.0 mg/L是茶多酚積累的最佳培養(yǎng)基.

2.5 不同愈傷組織中化學(xué)成分的比較

不同愈傷組織的醇提物的GC-MS分析結(jié)果如表4所示.從6個(gè)樣品中共檢出氨基酸類、多酚類、酯類、羧酸類、醇類、胺類、生物堿等48種成分.6個(gè)樣品中均檢測(cè)出表兒茶素，其相對(duì)含量分別為2.09%、2.08%、5.08%、2.14%、5.30%、2.90%，表兒茶素相對(duì)含量最高的是樣品5；此外，只在樣品2、3、5中檢測(cè)到了芥子酸.

表4 不同樣品的GC-MS分析

續(xù)表4

3 討論

3.1 愈傷組織的誘導(dǎo)與增殖

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類和濃度是愈傷組織誘導(dǎo)成功的關(guān)鍵.本研究發(fā)現(xiàn)，KT不能誘導(dǎo)愈傷組織的產(chǎn)生.2,4-D、NAA、6-BA雖能誘導(dǎo)出愈傷組織，但愈傷組織均生長(zhǎng)緩慢，且褐化嚴(yán)重，不利于增殖培養(yǎng).TDZ有利于愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖，尤其是當(dāng)TDZ質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時(shí)愈傷組織的誘導(dǎo)效果最好，誘導(dǎo)率可達(dá)到92.1%，且愈傷組織生長(zhǎng)旺盛，增殖最快.薛寒青等[9]研究發(fā)現(xiàn)，TDZ有利于大蒜愈傷組織的誘導(dǎo).康大力等[10]研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量濃度為1.0 mg/L 的TDZ有利于喜樹(shù)愈傷組織的生長(zhǎng).Wang等[11]研究也發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用TDZ時(shí)，狼毒愈傷組織的增殖效應(yīng)明顯.

3.2 愈傷組織中茶多酚的積累

本研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加IAA、TDZ有利于茶多酚的積累，而培養(yǎng)基中添加2,4-D、NAA則不利于茶多酚的積累.MS+IAA 1.0 mg/L和MS+TDZ 1.0 mg/L培養(yǎng)的愈傷組織茶多酚含量分別為17.0%和20.6%，遠(yuǎn)高于栽培植株的葉片茶多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)(12.94%).而杜鴻標(biāo)等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中附加KT、2,4-D時(shí)，有利于金牡丹茶愈傷組織茶多酚的合成，與本研究結(jié)果不一致，這可能是由于品種間的差異所致.

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CallusproliferationandaccumulationofteapolyphenolsofAnjiBaicha

LINYuxing，XIAOZefeng，TIANBirui，HAONa，WANGJunli

(College of Life and Environmental Sciences，Minzu University of China，Beijing 100081，China)

For utilization of Anji Baicha，the effects of different plant growth regulators on callus，proliferation and accumulation of tea polyphenols of Anji Baicha were investigated using leaf as explants.The results showed that TDZ was more effective for callus induction，proliferation and accumulation of tea polyphenols.The callus induction frequency reached 92.1 % when the concentration of TDZ was as high as 1.0 mg/L.The mass fraction of tea polyphenols was 20.6%，and the relative abundance of epicatechin increased to 5.3%.

Anji Baicha; callus proliferation; tea polyphenols; GC-MS analyses

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.06.009

2016-09-20

國(guó)家重大科學(xué)儀器設(shè)備開(kāi)發(fā)專項(xiàng)(2012YQ03026108)；高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計(jì)劃資助項(xiàng)目(B08044)；一流大學(xué)一流學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(ydzxxk201619)

林昱星(1992—)，女，新疆烏魯木齊人，中央民族大學(xué)在讀碩士研究生，主要從事生物資源保護(hù)和利用方面的研究.E-mail：1011421595 @qq.com

王俊麗(1964—)，女，河北新樂(lè)人，中央民族大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物細(xì)胞工程及資源利用研究.

E-mail：wangjunli1698@163.com

Q945

A

1000-1565(2017)06-0614-07

趙藏賞)