脫除赭曲霉毒素A的枯草芽孢桿菌CW14搖床培養條件優化

章雨馨，葉婉瓊，孫正陽，梁志宏

(中國農業大學北京食品營養與人類健康高精尖創新中心 食品科學與營養工程學院，北京 100083)

脫除赭曲霉毒素A的枯草芽孢桿菌CW14搖床培養條件優化

章雨馨，葉婉瓊，孫正陽，梁志宏*

(中國農業大學北京食品營養與人類健康高精尖創新中心 食品科學與營養工程學院，北京 100083)

以一株具有降解赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)能力的枯草芽孢桿菌BacillussubtilisCW14為材料，采用單因素試驗和正交試驗，對其發酵初始pH值、培養基配比、培養溫度和轉速等4個因素進行優化。試驗結果表明，B.subtilisCW14搖床培養的最佳條件是：初始pH值為7.0，培養基胰蛋白胨與酵母浸粉配比為10∶5，發酵溫度為37 ℃，轉速為200 r·min-1。在此條件下培養，其菌體密度最大可達1.56×108cfu·mL-1，OTA脫除率達83.91%。

枯草芽孢桿菌； 單因素試驗； 正交試驗； 優化

真菌毒素是真菌在生長過程中所產生的一些次級代謝產物，廣泛存在于谷物和飼料中，對人畜健康危害極大。常見的真菌毒素有黃曲霉毒素(aflotoxins)、赭曲霉毒素(Ochratoxins，OTs)、玉米赤霉烯酮(zearalenone)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol)、T-2毒素(trichothecenes)、伏馬菌素(fumonisin)等。

赭曲霉毒素OTs是L-β-苯基丙氨酸與異香豆素的聯合，有A、B、C、D 4種化合物，此外還有赭曲霉毒素A的一些代謝產物，如4-R-羥化赭曲霉毒素、4-S-羥化赭曲霉毒素、10-羥化赭曲霉毒素，以及赭曲霉毒素B的代謝產物赭曲霉毒素β等，都是結構類似的化合物。這些物質在化學結構上只有細微差異，但在毒理學方面卻差別很大。其中，以赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)分布最普遍，毒性最強，并且最易檢出[1]。OTA屬于腎毒性真菌毒素，可導致人和動物的腎疾病。1993年國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer，IARC)將OTA定為“可能的人類致癌物”，即2B類致癌物。OTA被認為是巴爾干地方性腎炎與慢性間質性腎病這2種慢性疾病的病因，甚至會引發人類腎腫瘤[2]。此外，該毒素還具有肝毒性、致畸性，以及抑制免疫系統的毒性，其中致畸性具有物種選擇性[3]。

近年來，國內外有關OTA脫毒的研究很多。有的研究OTA合成的影響因素，例如環境、營養基質等。有研究表明，精氨酸(Arg)能抑制OTA的生物合成[4]。但更多的研究集中于OTA的脫除。OTA的脫毒方法主要有化學脫毒、物理吸附和生物脫毒，且目前比較成熟的技術主要為化學脫毒和物理吸附。但化學脫毒和物理吸附因存在副作用、費用較高、影響食品的風味和營養等原因不利于推廣應用。生物脫毒利用微生物作用去除毒素毒性，副作用小，環境友好，是一種較為理想的脫毒方法，現已成為世界各國競相研究的熱點。

芽孢桿菌(Bacillusspp.)具有對OTA的脫毒能力，但報道的菌株相對較少，而且脫毒能力不盡相同。有研究報道從新鮮的麋鹿糞便中分離到一株枯草芽孢桿菌CW14，對OTA有較強脫除效果[5]。我國農業部允許將枯草芽孢桿菌用作飼料添加劑，并重點應用于微生物制劑方面。本研究采用單因素試驗和正交試驗對功能菌株B.subtilisCW14搖床培養條件進行優化，獲得脫毒菌株最優培養條件，為今后進一步研究此菌的脫毒機理以及工業發酵生產獲得脫毒制劑提供材料和數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌種

從新鮮的麋鹿糞便中分離到的枯草芽孢桿菌CW14(B.subtilisCW14)，于本實驗室鑒定與保藏。

1.1.2 培養基及試劑

LB培養基：酵母浸粉5.0 g·L-1，NaCl 10.0 g·L-1，胰蛋白胨10.0 g·L-1，pH 7.0。固體培養基加1.5%的瓊脂，121 ℃滅菌20 min。

鹽酸，分析純；氫氧化鈉，分析純。

1.1.3 主要儀器設備

HZQ-X160全振蕩培養箱，江蘇太倉市實驗設備廠；MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋，北京天林恒泰科技有限公司；超凈工作臺，北京半導體設備一廠；PHX型智能生化培養箱，寧波萊福科技有限公司；3001-1669全波長掃描酶標儀，Thermo Fisher Scientific Oy(芬蘭)。

1.2 菌種活化

-80 ℃甘油保存的B.subtilisCW14，取1 mL接種到100 mL LB液體培養基中，置于恒溫振蕩培養箱，37 ℃，200 r·min-1培養24 h活化。

配制LB液體培養基與LB固體培養基，利用平板菌落計數法得到培養后的菌體濃度，同時測定樣本的D600值，制得B.subtilisCW14菌液濃度與D600值的對應關系曲線。調整初始接種濃度達到106cfu·mL-1。

1.3 單因素試驗

1.3.1 搖床發酵溫度對菌體數量的影響

設置搖床發酵溫度分別為32、37、42 ℃，在初始pH值7.0、裝液量100 mL·250 mL-1、接種量1%、轉速200 r·min-1條件下振蕩培養24 h，每組設置2個重復，測定D600值。

1.3.2 搖床轉速對菌體數量的影響

設置搖床轉速分別為180、200、220 r·min-1，在初始pH值7.0、裝液量100 mL·250 mL-1、接種量1%、溫度37 ℃條件下振蕩培養24 h，每組設置2個重復，測定D600值。

1.3.3 搖床初始pH值對菌體數量的影響

將LB培養基的初始pH值使用1 mol·L-1HCl或1 mol·L-1NaOH溶液分別調至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，121 ℃高壓滅菌20 min后，在裝液量100 mL·250 mL-1、接種量1%、轉速200 r·min-1、溫度37 ℃條件下振蕩培養24 h，每組設置2個重復，測定D600值。

1.3.4 培養基成分配比對菌體數量的影響

配制胰蛋白胨與酵母浸粉配比分別為8∶7、9∶6、10∶5、11∶4、12∶3的液體培養基，121 ℃高壓滅菌20 min后，在裝液量100 mL·250 mL-1、接種量1%、轉速200 r·min-1、溫度37 ℃條件下振蕩培養24 h，每組設置2個重復，測定D600值。

1.4 搖床培養條件的正交試驗優化

在搖床單因素試驗培養條件優化的基礎上，適當縮小各個因素的范圍，根據正交試驗表L9(34)進行4因素3水平的正交試驗，培養24 h。具體地：發酵溫度(A)的3個水平分別為35 ℃(A1)、37 ℃(A2)、39 ℃(A3)，轉速(B)的3個水平分別為180 r·min-1(B1)、200 r·min-1(B2)、220 r·min-1(B3)，初始pH值(C)的3個水平分別為6.5(C1)、7.0(C2)、7.5(C3)，培養基配比(胰蛋白胨與酵母浸粉配比，D)的3個水平分別為9∶6(D1)、10∶5(D2)、11∶4(D3)。每組試驗設置3個重復，測定發酵培養液的D600值。

1.5 搖床培養優化條件下菌濃測定以及優化發酵液脫除OTA的研究

在最優培養條件下測定D600，并使用高效液相色譜(HPLC)對最優條件下OTA脫毒效果進行檢測。具體地：三氯甲烷樣用氮吹儀吹干(55 ℃)，加等量甲醇溶解，流動相為乙腈∶水∶乙酸(體積比)=100∶100∶1，流速1 mL·min-1，上樣量20 μL(如果出現平峰，等倍稀釋樣品和對照)，檢出限0.02 ng。

OTA降解率的計算：降解率=(1-對照峰面積/樣品峰面積)×100。

1.6 統計分析

每組試驗結果重復3次，采用SPSS 20.0進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 發酵溫度對培養液菌體數量的影響

統計分析發現，37 ℃組與32 ℃、42 ℃組均表現出顯著差異(P<0.05)，說明CW14菌株對溫度比較敏感，最適溫度區域較窄，溫度過高或過低都會使細胞內蛋白質及酶的活性受到抑制。根據單因素試驗結果(圖1)，發酵溫度以37 ℃為宜。

柱上無相同字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖2～4同圖1 不同發酵溫度對枯草芽孢桿菌CW14培養液菌體數量的影響

2.2 搖床轉速對培養液菌體數量的影響

如圖2所示：轉速較低時，菌體數量隨轉速的增大而增大，當轉速達到200 r·min-1時，菌體數量最大，之后隨轉速增大而略有減小。這是因為，低轉速條件下，提高轉速能增大培養基與氧氣的接觸面積，加快物質交換速率，延長細小氣泡在發酵液中的滯留時間，提高供氧能力，從而加快菌體生長繁殖；而在較高轉速條件下，溶氧系數降低，供氧能力降低，而且伴隨明顯的剪切力，促使菌體自溶，菌體數量降低[6]。考慮到生產工藝、能耗及高轉速對設備磨損的影響等因素，CW14菌株的搖床轉速以200 r·min-1為宜。

圖2 不同搖床轉速對枯草芽孢桿菌CW14培養液菌體數量的影響

2.3 搖床初始pH值對培養液菌體數量的影響

培養基pH值會通過影響細胞代謝相關酶活性和細胞中物質的離子化程度，進而影響微生物的生長代謝[7]。如圖3所示：當pH≤7時，菌體數量隨pH值的增大而增大，但處理間無顯著差異；當pH>7時，菌體數量驟減，且顯著(P<0.05)低于pH<7時各處理的菌體數量。pH=7時，菌體數量最大，而且無論是從菌體培養獲得生物量的角度，還是從發酵獲得代謝物，以及后期的分離純化等角度考慮，中性條件都具有很好的操作優勢；因此，CW14菌株培養時初始pH值宜選擇為7。

圖3 不同初始pH值對枯草芽孢桿菌CW14培養液菌體數量的影響

2.4 培養基成分配比對培養液菌體數量的影響

如圖4所示，胰蛋白胨與酵母浸粉配比為9∶6與10∶5組的培養液菌體數量最大，顯著(P<0.05)高于其他處理。總體來看，當酵母浸粉的比重過低時，會影響菌的生長。這是因為，酵母浸粉中含有豐富的氨基酸、水溶性維生素以及多糖，雖然胰蛋白胨中也含有部分氨基酸，但是缺乏半胱氨酸、甲硫氨酸等含硫氨基酸，因此胰蛋白胨與酵母浸粉需要配合使用，以二者配比10∶5效果最佳。

圖4 不同培養基成分配比對枯草芽孢桿菌CW14培養液菌體數量的影響

2.5 搖床培養條件的正交試驗優化

正交試驗結果(表1)顯示，各因子對菌體生長的影響依次為初始pH值(C)>培養基配比(D)>搖床轉速(B)>發酵溫度(A)。菌體生長的最佳培養條件組合是A2B2C2D2，即發酵溫度37 ℃、搖床轉速200 r·min-1、初始pH值7.0、培養基配比10∶5。試驗顯示，在此條件下培養，菌液D600達0.854，即菌體密度達1.56×108cfu·mL-1。對最優條件下OTA脫除效果進行檢測，發現脫毒能力達到83.91%，證明經過培養條件優化后的枯草芽孢桿菌對OTA依然保有很強的脫除活性。

表1 正交試驗設計及結果分析

3 小結與討論

CW14是一株具有脫除OTA能力的功能菌株。本研究將其作為試驗材料，對影響其生長的因素進行探索，正交試驗結果顯示，CW14的最佳搖床培養條件為：溫度37 ℃，轉速200 r·min-1，培養液初始pH值7.0，胰蛋白胨與酵母浸粉配比10∶5。各因子對菌體生長影響的權重依次為初始pH值>培養基配比>轉速>發酵溫度。在后期的應用研究或發酵罐擴大培養階段，應優先關注培養液初始pH值的調整。

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2017-09-19

中央高校基本科研業務費專項資金(2015SP005)

章雨馨(1996—)，女，安徽黃山人，本科生，研究方向為食品微生物，E-mail：zhangyuxin@cau.edu.cn。

梁志宏(1969—)，女，內蒙古呼和浩特人，副教授，博士，從事微生物與食品安全方面的研究工作，E-mail：lzh105@cau.edu.cn。

文獻著錄格式：章雨馨，葉婉瓊，孫正陽，等. 脫除赭曲霉毒素A的枯草芽孢桿菌CW14搖床培養條件優化[J].浙江農業科學，2017，58(12)：2242-2245.

10.16178/j.issn.0528-9017.20171250

TS201.3

A

0528-9017(2017)12-2242-04

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