表兒茶素沒食子酸酯抑菌活性的研究①

陳星卉

(哈爾濱商業大學，黑龍江 哈爾濱 150028)

表兒茶素沒食子酸酯抑菌活性的研究①

陳星卉

(哈爾濱商業大學，黑龍江 哈爾濱 150028)

目的：探討表兒茶素沒食子酸酯抑菌活性。方法：本研究通過二倍稀釋法測量最小抑菌圈從而確定ECG對6種致病菌的最小抑菌濃度(MIC)。采用結晶紫實驗對表兒茶素沒食子酸酯作用前后細菌細胞膜完整性的變化進行測定。結果：表兒茶素沒食子酸酯對大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、變異鏈球菌、綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC值0.125mg/mL;結晶紫實驗中，隨著ECG濃度的增大，OD590也隨之增大。結論：實驗證明ECG的滅菌機制是對其細菌細胞膜通透性進行改變，并破壞細胞膜的完整性，使細胞外的小分子容易進入以及引起細胞內的小分子物質泄漏。

表兒茶素沒食子酸酯；抑菌活性；最小抑菌濃度；致病菌

表兒茶素沒食子酸酯(簡稱ECG)是從綠茶中分離得到的一種具有廣譜抗菌作用的活性物質。本研究擬進一步探索ECG對綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、變異鏈球菌(Streptococcus mutans)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)等常見致病菌是否存在抗菌作用，從而研究 ECG對上述6種致病菌抗菌活性及抗菌機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨著廣譜抗菌藥物使用頻繁，致使很多細菌產生了耐藥性。為了降低細菌耐藥性產生，我們應該合理的使用抗菌藥物。因此在天然藥物中對新型抗菌活性成分的研發，可以緩解耐藥性的問題。表兒茶素沒食子酸酯是從綠茶中提取的活性物質，是茶多酚的主要成分之一，其含量約為24%[1]。具有抗癌、抗突變、防治心腦血管系統疾病以及調理內分泌、提高機體免疫力等生物活性[2～4]，同時也可以抑制機體內生物代謝酶從而抑制新陳代謝作用。早些年，國內外學者對茶葉及其茶多酚的藥理活性的研究進展進行過系統分析[5～6]。發現其具有高效低毒的抗腫瘤[7]、抗氧化、抗菌、治療心血管疾病等的潛能[8]。蔡軼等[9]研究了表兒茶素沒食子酸酯對對人鼻咽癌C666 -1細胞凋亡的影響，初步證實了表兒茶素沒食子酸酯人鼻咽癌C666 -1細胞[10]具有顯著的增殖抑制作用。焦嬋媛[11]等對表兒茶素及其衍生物表兒茶素沒食子酸酯抑制前列腺間質細胞增值,得出ECG抑制前列腺間質細胞增殖的作用機制是通過ERK44/42進行的。表兒茶素沒食子酸酯也可以與傳統廣譜抗菌藥物協同作用從而提高其抑菌效果，華德興[12]等人對表兒茶素沒食子酸酯與四環素進行協同實驗，研究其抗金黃色葡萄球菌作用及機制從而得出ECG與抗生素類藥物的協同抗菌效果會增強。

1.2 方法

1.2.1表兒茶素沒食子酸酯對致病菌MIC的測定

參照瓊脂稀釋法測定致病菌的MIC[13]，將試驗方法改進，配制八種不同濃度的ECG。

在超凈工作臺中進行操作，準備直徑0.75cm的濾紙片48個；采用二倍稀釋法配制八種濃度不同的ECG溶液；準備六個固體培養基，每個固體培養基平皿背面做好標記1.2.3.4.5.6.7.8；取濾紙片浸入2mg/mLECG溶液中放在平皿“1”位置，取第二張濾紙片浸入1mg/mLECG溶液中放在平皿“2”位置，按上述步驟依次放置浸泡過藥品溶液的濾紙片在固定位置，每個平皿放八個不同濃度藥品溶液的濾紙片；放入37℃恒溫培養箱中過夜培養；測量抑菌圈的直徑，最小直徑的抑菌圈所對應的藥品濃度即為該致病菌的MIC值，具體濃度配置可見表1。

表1 ECG溶液的配制

1.2.2 致病菌細胞的完整性變化觀察

行離心操作，8000r/min下離心棄上清液；加入0.5%NaCl溶液200μL進行洗滌再重懸；取致病菌懸液200μL取6個離心管，標號，分別均勻的加入已經接種過致病菌的營養肉湯液體培養液40mL；進分裝在規格1mL的離心管中分別加入不同濃度藥物(MIC作為最大濃度，依次2倍稀釋：2MIC，MIC，0.5MIC、0.5%NaCl)200μL；將離心管放入恒溫培養箱中37℃孵育8h；孵育完成后，進行離心取菌，加入200μL 的0.5%NaCl洗滌重懸；將1 mg/mL結晶紫溶液200μL加到各個離心管中，混勻后將離心管都放到恒溫培養箱中37℃孵育10min；孵育完成后，再進行離心操作，取上清液進行UV 590nm下測吸光度。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 表兒茶素沒食子酸酯MIC的測定結果

按最小抑菌濃度測定操作方法操作，測量六種致病菌的固體培養基上8個不同濃度濾紙片所產生的抑菌圈直徑大小比較，直徑。所以表兒茶素沒食子酸酯對大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、變異鏈球菌、綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC值0.125mg/mL。抑菌圈直徑單位(cm)。見表2。

表2 MIC的測定結果

注：-代表沒有抑菌圈

2.2 結晶紫實驗結果

將六組致病菌的1～4號離心管按結晶紫測定操作方法，測定各個離心管內上清液590nm下的UV吸光度。大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、變異鏈球菌、綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌六組致病菌的1～4號離心管內藥物濃度依次為0.250mg/mL、0.125mg/mL、0.063mg/mL、0mg/mL。根據實驗結果，見表3。

表3 致病菌細胞膜完整性測定

根據上表2～3可知，隨著ECG濃度的增加，OD590也增加，說明ECG對致病菌細胞膜能造成破壞，并且隨著藥物ECG濃度的逐漸增大，致病菌細胞膜被造成的破壞更為嚴重(P<0.05)。見圖1。

圖1 ECG對于6種致病菌的OD590測定

3 討論

本實驗主要針對致病菌的細胞膜通透性作用，但是未完全考慮到ECG是否對大腸桿菌、綠膿桿菌等細菌的DNA、細胞壁或其它部位有無影響，若是條件允許，對其它部位也進行相關測定是有必要的。

[1]王倩如. 毛細管電色譜的研究進展及其在藥物分析中的應用[J]. 黑龍江醫藥科學, 2010, 33(5): 26-27

[2]毛小強, 那萬里, 趙丹, 等. 茶多酚對前列腺癌 PC-3M細胞增殖與凋亡的影響[J]. 中國實驗診斷學, 2010, 14(2):170-173

[3]李麗, 唐燕霞, 黃志明, 等. 表沒食子兒茶素沒食子酸酯對柔紅霉素致小鼠心臟毒性的預防作用[J]. 醫藥導報, 2014, (7):841-844

[4]陳悅, 劉秋慧. 茶多酚對豚鼠心肌細胞鈣電流及動作電位的影響[J]. 中國藥學雜志, 2010，45(3): 190-192

[5]Lung H L, Man O Y, Yeung M C, et al. SAA1 polymor-phisms are associated with variation in antiangiogenic andtumor-suppressive activities in nasopharyngeal carcinoma[J]. Oncogene, 2015, 34(7):887-889

[6]Fang C Y, Wu C C, Hsu H Y, et al. EGCG inhibits pro-liferation, invasiveness and tumor growth by up-regulation of adhesion molecules, suppression of gelatinases activi-ty, and induction of apoptosis in nasopharyngeal carcino-ma cells[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2015, 16(2): 2530-2558

[7]高君,王志華. 腫瘤生物治療的研究近況[J]. 黑龍江醫藥科學, 2007, 30(1):48-50

[8]朱松. 表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)酶法乙酰化分子修飾及其產物的抗氧化性能研究[D]. 無錫: 江南大學, 2014:37-51

[9]蔡軼, 魏沁, 蔡躍, 等. 表兒茶素沒食子酸酯對人鼻咽癌C666-1細胞凋亡的影響[J]. 華南師范大學學報(自然科學版), 2015, (4):103-107

[10]唐惠玲. NF-κB信號傳導與疾病研究進展[J]. 黑龍江醫藥科學,2012,35(5):34-36

[11]焦嬋媛, 景春暉, 員小婷, 等. 表兒茶素及其衍生物表兒茶素沒食子酸酯通過MAPK-ERK44/42通路抑制前列腺間質細胞增殖[J]. 天津中醫藥, 2017, (3):200-203

[12]華德興, 許曉玲, 彭青, 等. 表兒茶素沒食子酸酯與四環素協同抗金黃色葡萄球菌作用及機制[J]. 中國新藥與臨床雜志, 2009, (12):935-939

[13]李艷捧, 段昕所, 陸潔, 等. 瓊脂稀釋法檢測6種藥物抗皮膚癬菌MIC[J]. 中國麻風皮膚病雜志, 2004, (4):369-372

[14]陳兵,賀娟,張春斌. 氧化應激的原理及作用[J]. 黑龍江醫藥科學, 2014, 37(6):2-3

[15]呂冬霞,王曉麗,魏鳳香,等. 玉米須多糖誘導人肝癌SMMC-7721細胞凋亡的研究[J]. 黑龍江醫藥科學,2006,29(4):28-29

陳星卉(1995～)女 ，黑龍江佳木斯人，學士。

R978.1

B

1008-0104(2017)06-0129-02

2017-06-16)