布拉氏酵母菌對潰瘍性結腸炎模型大鼠Treg/Th17免疫平衡的調節作用①

陳 沖，顏 玉，王艷鳳

(1.佳木斯大學研究生部，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學附屬第一醫院消化一科，黑龍江 佳木斯 154003)

布拉氏酵母菌對潰瘍性結腸炎模型大鼠Treg/Th17免疫平衡的調節作用①

陳 沖1，顏 玉2，王艷鳳2

(1.佳木斯大學研究生部，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學附屬第一醫院消化一科，黑龍江 佳木斯 154003)

布拉氏酵母菌；潰瘍性結腸炎；Treg/Th17平衡

1 材料與方法

1.1 材料

6～8周齡，24只清潔級健康雄鼠，體重均在200～230g，這些大鼠均來自于佳木斯大學動物實驗中心，動物許可證號：SCXK(黑)2013-001，分為正常對照組、模型組、藥物治療組。葡聚糖硫酸鈉DSS(北京賽珂瑪生物科技公司)，布拉氏酵母菌散(億活，深圳市康哲藥業有限公司)，水合氯醛(北京鼎國生物公司)，胎牛血清(杭州四季青生物公司)，CD4FITC(英國 Innova Bioscience公司)，CD4PE(Innova Bioscience公司)，大鼠TGF-β1 ELISA試劑盒(上海酶聯生物技術公司)，大鼠IL-6 ELISA試劑盒(上海酶聯生物技術公司)。石蠟切片機(德國Leica公司)，石蠟包埋機(德國Leica公司)，組織脫水機(德國Leica公司)，光學顯微鏡(日本Nikon公司)，PM-4000B圖像分析儀(德國Leica公司)，離心機(北京離心機廠LDZ5-2型)，全自動酶標儀(上海金達生化儀器公司)，FACS Calibur 流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模：在SD大鼠對環境適應7d之后，從中隨機抽出8只作為對照組，并給對照組服用消毒蒸餾水。剩余的16只服用DSS(用蒸餾水配置的5%葡聚糖硫酸鈉溶液)一周，以此來建立相關模型，7d后改為飲用消毒蒸餾水及常規飲食，觀察對比大鼠的一般狀況、體重及糞便變化。將利用DSS液制備的大鼠潰瘍性結腸炎模型隨機分為模型組、藥物治療組，每組8只。

1.2.2 給藥：從造模后第4天開始，藥物治療組給予布拉氏酵母菌800mg/kg，溶于1mL生理鹽水中灌腸，1次/天，連續7d。建立模型的第11天，大鼠24h禁止進食，然后稱其體重，并將10%的水合氯醛麻醉注射到大鼠腹腔中，同時將腹主動脈進行分離，用肝素抗凝管取出5mL血液。將結腸分離出，并將病變組織切成腸段，每段長1cm，然后將腸段放到4%的多聚甲醛中進行固定，用常規石蠟進行包埋，最后進行染色、切片處理，放到顯微鏡下進行觀察。

1.2.4 血漿TGF-β和IL-6量的檢測：取2mL肝素抗凝的血液300rpm/min，離心15min，取上清，分裝后放入-80℃冰箱保存，解凍后離心再進行檢測，檢測時血漿用樣本稀釋液稀釋10倍，具體步驟嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，根據樣品光密度(OD)值，查出相應濃度，然后乘以稀釋倍數，得到樣品實際濃度。

1.3 統計學方法

采用SPASS17.0統計軟件，獨立樣本t檢驗，所有數據以均數±標準差表示，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

HE染色光鏡(100×)觀察，正常對照組細胞排列有序，杯狀細胞沒有明顯的減少，見圖1； 模型組病變集中在黏膜下層和累及黏膜層，可以看出杯狀細胞明顯減少，腺體多數損傷，出現很多炎性細胞，見圖2；藥物治療組黏膜下層炎性細胞浸潤程度減輕，腺體排列不整齊，少量纖維素樣滲出，見圖3。

圖1 正常對照組大鼠腸黏膜(100×)

圖2 潰瘍性結腸炎模型組大鼠腸黏膜(100×)

圖3 布拉氏酵母菌治療組大鼠腸黏膜(100×)

模型組比正常對照組大鼠外周血Treg降低(t=2.143，P<0.05)，藥物治療組比模型組大鼠外周血Treg升高(t=1.940，p<0.05)；模型組比正常對照組大鼠外周血Th17升高(t=2.151，P<0.05)，藥物治療組比模型組大鼠外周血Th17降低(t=1.844,P<0.05)；模型組比正常對照組大鼠Treg/Th17比值降低(t=2.501,P<0.05)，藥物治療組比模型組大鼠Treg/Th17比值升高(t=1.901,P<0.05)。模型組比正常對照組大鼠TGF-β1下降(t=2.531,P<0.05)，而IL-6升高(t=2.503,P<0.05)；藥物治療組比模型組大鼠TGF-β1升高(t=1.901,P<0.05)，而IL-6降低(t=1.895,P<0.05)。見表1。

表1 布拉氏酵母菌對UC大鼠Treg/Th17免疫平衡的影響

3 討論

UC的發病機制主要由免疫反應介導引起是目前普遍認可的原因，認為主要是遺傳與環境及細菌協同作用，而腸道細菌是引起潰瘍性結腸炎發病主要原因[3]。UC的治療藥物有柳氮磺吡啶、糖皮質激素、免疫抑制劑。安全、有效、副作用小的治療方法是UC的研究熱點。研究表明，益生菌治療UC能夠改善腸道微環境、延長緩解時間、降低UC相關結腸癌發生[4]。因此益生菌可能是未來最有希望治療UC的方法之一。

Th17細胞可以產生IL-17，在很多免疫性損傷中都有積極的作用，Treg可以采用介導免疫耐受的方式來阻止其本身免疫性疾病的產生[5]。在多種自身免疫性和炎癥性疾病中，發現Treg細胞數量下降或功能減弱[6]。機體發生炎癥反應或自身免疫性疾病時Th17增加，是破壞體內Treg/Th17平衡的原因之一。轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是Th17分化所必需的細胞因子，對于Treg的分化具有調節作用。低濃度TGF-β1與IL-6協同，誘導初始T細胞向Th17分化；高濃度TGF-β1使T細胞分化為Treg[7]。因此TGF-β1分泌量的變化協同IL-6影響機體Treg/Th17平衡，免疫穩態打破時，IL-17增加，Treg減弱，引發一系列炎癥反應，從而導致UC的發生。

[1]劉梓峰,郭珍,李燕舞,等.潰結靈對潰瘍性結腸炎大鼠外周血Treg/Th17平衡的干預作用[J].中藥新藥與臨床藥理，2015,(1):1-5

[2]許海英，顏玉，姜威，等.益生菌聯合美沙拉嗪對大鼠潰瘍性結腸炎Claudin-1及TLR4的影響[J].黑龍江醫藥科學，2016,39(4)：52-54

[3]顏玉，任秀英，鮑秀琦，等.艾迪莎聯合益生菌膠囊對潰瘍性結腸炎模型大鼠的治療及炎性細胞因子表達影響[J].黑龍江醫藥科學，2015,38(4)：56-57

[4]方凱，王藝宙，王慧，等.益生菌治療潰瘍性結腸炎的研究進展[J].藥物生物技術，2013,21(3):270-273

[5]Haruei O,Kazuhiko N,Tsutom I,et al.Regulatory T cells expanded by rapamycin in vitro suppress colitis in an experimental mouse model[J].J Gastroenterol,2012,47(4):366-376

[6]葛婷，唐志鵬，王亮，等.Treg/Th17失衡與炎癥性腸病的關系[J].世界華人消化雜志，2010,18(7)：689-694

[7]王程玉林,孫軍剛,耿煜,等.Treg/Th17平衡軸在潰瘍性結腸炎發病中的意義及流式細胞術檢測進展[J].免疫學雜志，2015,(6):541-544

佳木斯大學研究生科技創新項目，編號：YM2016_020。

陳沖(1989～)女，黑龍江牡丹江人，在讀碩士研究生。

顏玉(1963～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，教授，主任醫師，碩士研究生導師。E-mail:drchenchong@ 163.com。

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1008-0104(2017)06-0059-02

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