連翹酯苷A對內毒素致雞血白介素-17和白介素-6水平的影響①

程廣東，張 強，岳麗紅，關楠楠，周清波，付釣鈞，王 萌，李艷華

(1．佳木斯大學生命科學學院，黑龍江 佳木斯154007；2．東北農業大學動物醫學學院，黑龍江 哈爾濱150030；3.佳木斯大學公共衛生學院，黑龍江 佳木斯 154007)

連翹酯苷A對內毒素致雞血白介素-17和白介素-6水平的影響①

程廣東1,2，張 強3，岳麗紅1，關楠楠1，周清波1，付釣鈞1，王 萌3，李艷華2

(1．佳木斯大學生命科學學院，黑龍江 佳木斯154007；2．東北農業大學動物醫學學院，黑龍江 哈爾濱150030；3.佳木斯大學公共衛生學院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：研究連翹酯苷A和內毒素作用雞后，雞脾器官指數、雞血IL-17 和IL-6 mRNA表達量與蛋白含量與炎癥反應關系。方法：選取80只1d齡健康AA肉雞隨機分為4組，分別為control組，LPS組，30組(30 mg·kg-1連翹酯苷低劑量組)和60組(60 mg·kg-1連翹酯苷高劑量組)，各組雞收集雞脾臟、血和血清，計算雞脾臟器官指數、通過采用qRT-PCR和ELISA方法檢測血液和血清中IL-17 和IL-6水平。結果：與正常組相比，LPS組脾器官指數上升，血液中IL-17 和IL-6 mRNA 表達量升高；與LPS組比較，連翹酯苷A劑量組脾器官指數下降，血液中IL-17和IL-6 mRNA表達量下降；與正常組相比，LPS組血清中IL-17 和IL-6蛋白含量升高；與LPS組比較，連翹酯苷A組血清中IL-17 和IL-6蛋白含量下降。結論：試驗表明連翹酯苷A可以通過基因和蛋白水平抑制LPS誘導的雞血中IL-17 和IL-6 mRNA表達量和蛋白含量的升高，起到免疫調節作用，達到抗炎效應。

連翹酯苷A；脂多糖；雞；白介素-17；白介素-6

內毒素又稱脂多糖，是革蘭氏陰性細菌細胞壁的組分之一，常被用于構建炎癥模型，引發機體炎癥反應[1]。而連翹酯苷A單體是連翹的主要成分之一，具有連翹的鎮痛、解熱、抗氧化、抗病毒及抗菌等活性，可通過介導一些炎癥通路和免疫因子，調控機體免疫反應。脾臟和血液是發生免疫應答的主要場所，當機體發生病變，免疫因子含量往往發生變化，血液是許多免疫事件發生的主要場所，也是各種免疫細胞重要載體，在機體的免疫活動中起著重要作用。為此，血液和脾臟免疫指標常被作為判斷疾病的依據。IL-17和IL-6是免疫反應中重要的促炎因子，張偉潔等[2]報道IL-6是自身免疫性疾病和慢性炎癥中主要炎癥因子，其含量變化對診斷疾病起著重要作用。IL-17由IL-17A～F等6個家族成員組成，是一種促炎因子[3，4]。IL-17與IL-17受體反應后引起生物學效應，促進機體IL-6等炎癥因子產成，增強炎癥反應，在機體的免疫性疾病和腫瘤中等也起到重要作用[5，6]。故本研究采用LPS構建雞炎癥模型，在連翹酯苷A作用下，檢測雞血液中IL-17和IL-6等炎癥因子含量，研究藥物作用的時間和劑量效應，分析IL-17和IL-6 蛋白和mRNA之間的關系，從IL-17和IL-6轉錄和翻譯水平，探討連翹酯苷A抗LPS誘導的雞血液炎癥中的機制，為連翹酯苷A作為中藥添加劑在雞免疫調控中的作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與主要儀器

1日齡AA肉雞均購自哈爾濱獸醫研究所動物中心。主要試劑盒：ELISA等試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。LPS和連翹酯苷 A(純度>98%)購于黑龍江四葉草生物科技有限公司。實時熒光染料購于上海羅氏公司。主要儀器：LightCycler480(美國Roche公司)，酶標儀型號(瑞士TECAN-F50) 。

1.2 試驗方法

1.2.1 實驗分組與處理

80只1日齡雛雞被隨機分為4組，每組20只，分別為：control組，LPS組，30 mg·kg-1連翹酯苷低劑量組(30組)和60 mg·kg-1連翹酯苷高劑量組(60組)。正常飼養14d，當雞生長到15d齡時，開始對各組雞分別進行處理。以30 mg·kg-1和60 mg·kg-1連翹酯苷A劑量對連翹酯苷低劑量組和連翹酯苷高劑量組雞進行灌胃，以相同劑量生理鹽水給其余兩組雞灌服；生長至21d齡時，除control組雞外，其余組雞均以200μg·kg-1劑量LPS翅內靜脈注射，3h后，稱重所有雞，心臟采血并處死，將雞心臟血收集分為三部分，一部分分裝到1.5mL EP管中，并立即加入TRIZOL，用來提取血液中RNA；一部分收集到試管中，傾斜放置在4℃冰箱析出血清，用來檢測蛋白含量；一部分加入5%檸檬酸鈉至于小燒杯中，獲得全血；做好標記，并無菌剖檢分離雞脾臟，電子天平稱重，并計算雞脾器官指數。

1.2.2 ELISA檢測血清中IL-17和IL-6蛋白含量

將試管中析出血清收集并分裝到1.5mL EP管中，做好標記，按程廣東[7]論文中操作說明檢測各組血清樣品IL-17和IL-6含量。

1.2.3 qRT-PCR檢測全血中IL-17和IL-6 mRNA表達量

將0.9mL TRIZOL試劑直接加到裝有0.5mL全血的1.5mL EP管中，快速提取RNA，經逆轉錄為cDNA，并以cDNA為模板，檢測雞血液中IL-17和IL-6的CP值，β-actin作為內參校正，利用歸一法比較各組雞血液中IL-17和IL-6的mRNA表達量。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 連翹酯苷A抑制LPS致炎雞臨床癥狀

見表1。

試驗發現，與正常組雞相比，LPS組雞精神狀態低迷、不愿走動、肛門及尾部區域有糞便污染、觸摸雞體溫升高、飲食量下降、飲水量上升；而連翹酯苷A劑量組雞癥狀僅出現輕微的食欲下降，其余癥狀與正常組相同。

2.2 連翹酯苷A抑制LPS致炎雞脾器官指數的影響

見表1。

表1 連翹酯苷A抑制LPS致炎雞脾器官指數

由表1可見，與正常組雞脾器官指數比較，LPS組雞脾器官指數極顯著上升(P<0.01)，連翹酯苷A低劑量組顯著上升(P<0.05)，高劑量組差異極顯著上升(P<0.01)；與LPS組雞脾器官指數比較，連翹酯苷 A低劑量組雞脾器官指數顯著下降(P<0.05)，與高劑量組雞脾器官指數差異不顯著。

2.3 血清中IL-17和IL-6蛋白含量

見圖1。

圖1 連翹酯苷A對LPS致炎雞血清中IL-17和IL-6蛋白含量的影響

由圖1可見，與正常組雞血清比較，LPS組雞血清中IL-17蛋白含量極顯著增加(P<0.01)；連翹酯苷A組雞血清中IL-17蛋白含量升高，30mg·kg-1濃度的連翹酯苷 A可極顯著增加雞血清中IL-17蛋白含量(P<0.01)。與LPS組相比，30mg·kg-1和60mg·kg-1濃度的連翹酯苷 A均可抑制LPS誘導的雞血清中IL-17蛋白含量，并與60mg·kg-1濃度的連翹酯苷A組差異極顯著(P<0.01)，表明連翹酯苷A在抑制LPS誘導炎癥方面具有一定的劑量效應。與正常組雞血清比較，LPS組雞血清中IL-6蛋白含量極顯著增加(P<0.01)；30mg·kg-1濃度的連翹酯苷 A使雞血清中IL-6蛋白含量極顯著增加(P<0.01)，60mg·kg-1濃度的連翹酯苷A組使雞血清中IL-6蛋白含量極顯著下降(P<0.01)。與LPS組雞血清比較，連翹酯苷A組中IL-6蛋白含量下降，并成劑量效應關系，30mg·kg-1濃度的連翹酯苷 A可顯著抑制雞血清中IL-6蛋白含量(P<0.05)，60mg·kg-1濃度的連翹酯苷A可極顯著抑制雞血清中IL-6蛋白含量(P<0.01)。

2.4 全血中IL-17和IL-6 mRNA的表達量

見圖2。

圖2 連翹酯苷A對LPS致炎雞血液中IL-17和IL-6 mRNA表達量的影響

由圖2可見，雞血液中 IL-17和IL-6的實時熒光定量檢測結果，與正常組雞血液相比，LPS組雞血液中 IL-17 mRNA的表達量極顯著升高(P<0.01)；與LPS組雞血液比較，連翹酯苷 A劑量組IL-17 mRNA的含量極顯著下降(P<0.01)，表明30 mg·kg-1和60mg·kg-1濃度的連翹酯苷 A均可抑制LPS誘導的IL-17 mRNA的表達量。與正常組比較，LPS組雞血液中IL-6的mRNA表達量極顯著升高(P<0.01)；與LPS組雞血液比較，30mg·kg-1和60mg·kg-1濃度的連翹酯苷 A劑量組可明顯抑制LPS誘導的IL-6 mRNA的表達量(P<0.01)。

3 討論

3.1 連翹酯苷A對LPS致炎雞臨床癥狀

試驗發現LPS組雞低頭、狀態低迷、肛門及尾部區域有糞便污染、接觸雞體溫升高、飲欲增強、飲食減少，而連翹酯苷A劑量組雞飲食欲基本正常，這表明LPS能引起雞炎癥反應，表現為體溫升高、飲水量上升等；而一定濃度的連翹酯苷A可減輕LPS引發的炎癥反應，表現為雞體溫下降、飲水量基本恢復正常等。

3.2 連翹酯苷A對LPS致炎雞脾器官指數的影響

多項研究[8,9]報道一些物質可促進雛雞的免疫器官發育，使免疫器官指數升高。本試驗發現本試驗表明連翹酯苷A和LPS均影響脾器官指數，LPS組雞脾器官指數升高，而器官指數往往體現了機體的免疫水平，尤其免疫器官的器官指數，而脾臟作為外周免疫器官，器官指數的變化對機體狀態具有較好的提示作用。LPS使脾器官指數上升原因可能為LPS刺激脾臟活化，使脾臟的T、B淋巴細胞含量增多，脾重量迅速上升，使脾器官指數比正常組雞明顯升高，而與LPS組雞脾器官指數相比，連翹酯苷A可使脾器官指數下降，降低了脾臟的免疫水平，但由于一定程度上已活化了脾臟的T、B淋巴細胞，導致脾器官指數比正常組雞明顯升高，而脾器官指數體現機體的免疫水平，表明30mg·kg-1和60mg·kg-1濃度的連翹酯苷 A可增加機體的免疫力，進而抑制LPS引發的炎癥反應。

3.3 血液IL-17、IL-6表達量與免疫關系

梁正敏等[10]研究發現LPS可引起小鼠血清中IL-17與IL-6蛋白含量升高，而不同濃度復方腫節風溶液可降低小鼠血清中IL-17與IL-6蛋白含量，減輕由LPS引發的小鼠炎癥反應，這表明IL-17和IL-6蛋白在炎癥反應中起著重要作用。李璇等[11]研究發現IL-6在潰瘍性結腸炎大鼠血清含量升高，而潰瘍性結腸炎關系密切。潘佳秋等[12]研究發現IL-6在彌漫性毒性甲狀腺腫患者血清中升高，并且其可能與彌漫性毒性甲狀腺腫發病免疫學發病機制有關。蘇曉健等[13]研究發現LPS可使小鼠子宮內膜發生炎癥，通過識別天然免疫系統中Toll樣受體4，活化其下游信號級聯反應，引起下游TNF-ɑ等炎癥因子上升。德力拜爾,賽福丁等[14]研究發現阿魏根粗多糖對雞脾臟和外周血淋巴細胞體外增殖起到一定的作用，表明阿魏根粗多糖可通過影響機體重要免疫器官影響機體免疫水平。程廣東等[15]研究發現LPS和連翹酯苷A作用于雞后，雞法氏囊中炎癥因子mRNA表達量與蛋白含量之間存在相關性，整體上表現為炎癥因子mRNA表達量與蛋白含量變化趨勢一致，且有一定的時間和劑量效應。為此，推測血液中炎癥因子mRNA表達量與蛋白含量變化趨勢一致。此外，吳悅等[16]研究表明連翹酯苷可通過干預內毒素誘導的雞胸腺組織抗氧化功能介導免疫調節，表明連翹酯苷可通過介導抗氧化和炎癥因子指標調控炎癥反應。本試驗發現LPS可引起雞血中IL-17和IL-6 mRNA表達量與蛋白含量增加，而連翹酯苷A可導致LPS組雞IL-17和IL-6 mRNA表達量與蛋白含量下降，表明連翹酯苷A可能通過影響轉錄和翻譯水平抑制LPS組雞IL-17和IL-6 mRNA表達量與蛋白含量，進而通過炎癥通路調控免疫應答。

本試驗表明，LPS可引起雞血中IL-17和IL-6蛋白和mRNA表達量增加，而連翹酯苷A可導致LPS組雞血中IL-17和IL-6 蛋白和mRNA的表達量下降，整體上表現為IL-17和IL-6 mRNA表達量與蛋白含量變化趨勢一致，表明連翹酯苷A可通過抑制雞血中IL-17和IL-6 蛋白和mRNA表達量，抑制LPS誘導產生的炎癥效應，緩解炎癥反應。

[1]張學人.中藥提取物連翹酯苷A對內毒素血癥小鼠的免疫調節作用及相關機制研究[J]. 中醫藥導報,2016,22(21):57-60

[2]張偉潔,鄭宏. IL-6介導免疫炎性反應作用及其與疾病關系的研究進展[J]. 細胞與分子免疫學雜志,2017,33(05):699-703

[3]尹秀志,曲書強. IL-17在哮喘中的研究進展[J]. 臨床肺科雜志,2016,21(01):155-159

[4]王子萌,王維,馬毓蓉,等. IL-17A促進中耳上皮細胞凋亡加重組織損傷[J]. 免疫學雜志,2017,33(3):208-213

[5]Zrioual S, Toh M L, Tournadre A,et al. IL-17RA and IL-17RC receptors are essential for IL-17A-induced ELR-CXC chemokine expression in synoviocytes are overexpressed in theumatoid blood[J]. J Immunol, 2008, 180:655-663

[6]羅家明.IL-23/IL-17軸在EAE發病機制中的作用及其實驗性干預研究[D].重慶醫科大學,2008

[7]程廣東. 連翹酯苷A對雞脾和血中炎癥細胞因子及抗氧化性能影響[D].東北農業大學,2014

[8] 易先國. 茶多酚對固始雞雛雞生長發育的影響[J]. 動物醫學進展,2014,35(10):43-46

[9] 鄧留坤,高睿,沈文正. 胚蛋注射谷氨酰胺對肉仔雞早期免疫器官的影響[J]. 動物醫學進展,2011,32(05):86-89

[10]梁正敏,張明昕,彭健波,等. 復方腫節風溶液抗炎和平喘作用的研究[J]. 動物醫學進展,2017,38(04):120-125

[11]李璇,苗秋實,韓宇鵬,等. 潰瘍性結腸炎大鼠血清消褪素及白介素-6的含量及意義[J]. 黑龍江醫藥科學,2015,38(03):114-115

[12]潘佳秋,蔣宛純,張超. Graves病患者血清中趨化素與白介素6水平變化及相關性[J]. 黑龍江醫藥科學,2016,39(01):59-61

[13]蘇曉健,趙永旺,管遠紅. 脂多糖對小鼠子宮內膜中TLR4和TNF-α的影響[J]. 黑龍江畜牧獸醫,2015,(24):152-153

[14]德力拜爾,賽福丁.阿不拉,依不拉音.木沙,等. 阿魏根粗多糖對雞脾臟和外周血淋巴細胞體外增殖作用的影響[J]. 中國畜牧獸醫,2017,44(02):601-606

[15]Guangdong Cheng, Yulian Zhao, He Li, et al. Forsythiaside attenuates lipopolysaccharide induced inflammatory responses in the bursa of Fabricius of chickens by downregulating the NF-κB signaling pathway[J]. Experimental and therapeutic medicine, 2014,7(1):179-184

[16]吳悅,陳儉清,李鶴,等. 連翹酯苷對脂多糖誘導的雞胸腺組織抗氧化功能的影響[J]. 中國家禽,2013,35(19):15-18

EffectofForsythiasideAonIL-17andIL-6levelinblood
ofchickensinducedbylipopolysaccharide

CHENGGuang-dong1,2,ZHANGQiang3,YUELi-hong1,GUANNan-nan1
ZHOUQing-bo1,FUDiao-jun1,WANGMeng3,LIYan-hua2

(1.College of Life Science, Jiamusi University,Jiamusi 154007, China;2. College of Veterinary Medicine, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 3.College of Public Health, Jiamusi University, Jiamusi 154007,China)

Objective: To investigate the relationship among spleen organ index, inflammatory reaction, IL-17 and IL-6 protein and mRNA levels in blood of chicken after administrated by Forsythiaside A and Lipopolysaccharide (LPS).Methods80 AA broilers were selected and randomly divided into four groups, control group，LPS group， low Forsythiaside A dosage group and high Forsythiaside A dosage group. Spleen、blood and serum were collected for IL-17 and IL-6 level detection by qRT-PCR and ELISA.ResultsSpleen organ index, IL-17 and IL-6 mRNA blood levels in LPS group were increased compared with control group. Spleen organ index, IL-17 and IL-6 mRNA expression in Forsythiaside A groups were lower than LPS group. IL-17 and IL-6 mRNA expression in chicken blood were enhanced which was induced by LPS. Decreased protein expression of IL-17 and IL-6 in serum were observed in Forsythiaside A groups, as compared with LPS group.ConclusionsForsythiaside A achieved its immunomodulatory and anti-inflammatory effect by inhibiting the increased IL-17 and IL-6 expression induced by LPS in chicken.

Forsythiaside A; lipopolysaccharide; chicken; IL-17; IL-6

1.黑龍江省自然科學基金面上項目，編號：C201450；2.黑龍江省大學生創新創業項目，編號：201610222062；3.佳木斯大學校級青年科學基金項目，編號：Sq2013-028。

程廣東(1978～)男，黑龍江大興安嶺呼中人，博士，副教授。

李艷華(1970～)女，黑龍江密山人，博士，教授。 E-mail:liyanhua1970@163.com。

R285.5

A

1008-0104(2017)06-0025-03

2017-06-17)