黃芪皂苷I對Th1免疫反應的調節效應及機制研究

顧瑛媛+宋娜麗+萬春平

摘要：目的研究黃芪皂苷I的免疫調節作用以及作用的分子機理。方法構建絲裂原誘導脾淋巴細胞增殖細胞模型，測定黃芪皂苷I對ConA誘導T淋巴細胞增殖和LPS誘導B淋巴細胞增殖反應，構建anti-CD3 mAb抗體誘導T淋巴細胞增殖，RT-PCR檢測黃芪皂苷I對IL-2、IFN-γ和T-bet mRNA基因表達。結果黃芪皂苷I 在30nM顯著促進ConA 刺激T淋巴細胞增殖，差異有顯著性意義（P<0.05）；黃芪皂苷 I 體外用藥能夠顯著上調IFN-γ，T-bet的mRNA表達，而對IL-2表達水平無明顯影響。結論黃芪皂苷I可能特異性激活轉錄因子T-bet的轉錄，促進T 淋巴細胞增殖和細胞因子的產生。

關鍵詞：黃芪皂苷I；T淋巴細胞；Th1免疫反應；IFN-γ；T-bet

中圖分類號：R285.5文獻標志碼：A文章編號：1007-2349（2017）12-0072-03

【Abstract】Objective： To study the immunomodulatory effect of stragaloside I and its molecular mechanism. Methods： The splenic lymphocyte proliferation model induced by mitogen was established to determine the response of astragaloside I to T lymphocytes proliferation induced by ConA and B lymphocytes proliferation induced by LPS. T lymphocyte proliferation induced by anti-CD3 mAb antibody was established. RT-PCR was used to determine astragaloside I to the genetic expression of IL-2， IFN-γ and T-bet mRNA. Results： Astragaloside I significantly promoted the proliferation of T lymphocyte stimulated by ConA at 30 nM， and the difference was significant （P<0.05）. Astragaloside I administration in vitro significantly increased the mRNA expression of IFN-γ and T-bet， but had no significant effect on IL-2 expression. Conclusion： Astragaloside I may specifically activate the transcription of transcription factor T-bet and promote T lymphocyte proliferation and cytokine production

【Key words】Astragaloside I， T lymphocyte， Th1 immune response， IFN-γ， T-bet

扶正祛邪是中醫藥防治疾病的特色，被廣泛運用于各種疾病的治療。中醫認為“正氣內存，邪不可干”“邪之所湊，其氣必虛”。虛證指正氣虛弱，現代研究表明虛證患者常表現為細胞免疫功能低下，體液免疫功能紊亂。可見，“正氣”是機體免疫能力的一種中醫表達方式。黃芪是我國經典傳統補益中藥，具有健脾補中、升陽舉陷、益衛固表、利尿、托毒生肌之功效，《本草綱目》記載“可治一切氣衰血虛之癥”[1]。大量研究已證實，黃芪皂苷為黃芪主要活性成分[2-4]。黃芪甲苷能夠促進小鼠T、B淋巴細胞增殖和抗體生成，顯示出對細胞免疫和體液免疫較強的促進作用[5]。目前有關黃芪皂苷免疫調節活性研究主要集中在黃芪甲苷，其他皂苷組分研究較少，免疫調節作用機制尚未闡明。本論文旨在研究黃芪皂苷I的免疫調節作用，揭示其免疫調節的作用機理，為黃芪的臨床應用和配伍提供實驗依據。

1實驗材料

1.1實驗動物來源，種系，品系：BALB/c小鼠，7-8周齡，體重20-22 g，雌性，成都達碩生物科技有限公司提供，合格證號：SCXK（川）2008-24；動物飼養在SPF級動物房，實驗動物至少飼養一周后使用。溫度（22±1）℃，濕度（55±5）%，12 h光暗循環。飼料和水均在消毒后由動物自由攝取。所有實驗均嚴格按照實驗動物有關條例進行。

1.2主要藥物與試劑黃芪皂苷I由云南中醫學院左愛學博士提供，受試藥物呈白色粉末狀，純度>99%，用DMSO作為溶劑配置成5 mg/mL儲存液，-20℃保存備用，臨用前用RPMI-1640培養液稀釋成相應濃度；RPMI-1640培養基購自GibcoBRL公司（life Technologies，Grandisland，NY，USA）；胎牛血清（fetal bovine serum）購自Hyclone 公司（Logan，Utah，USA）；刀豆蛋白A（Concanavalin A，ConA）購自Sigma公司（St.Louis.MO，USA）；Trizol裂解液購置天根生化（北京）科技有限公司，其他試劑均為國產分析純。

1.3主要儀器離心機購自德國Thermo Scientific Heraeus；二氧化碳培養箱和生物安全柜均購自美國Thermo-fisher；Epoch連續波長酶標儀購自美國Bio-Tek公司。

2實驗方法及評價

2.1脾淋巴細胞的制備小鼠脫脊椎處死，無菌取其脾臟。將脾臟用玻璃片磨碎，過膜，于1200 rpm離心5 min。棄去上清，沉淀加入紅細胞裂解液（每個脾臟約1 mL），混勻，靜置1分鐘，加入PBS，離心。再加入PBS，過膜，離心。將所剩細胞洗滌1～2次后，用含10%FBS的RPMI-1640將細胞調至所需濃度。

2.2MTT法測定絲裂原誘導脾淋巴細胞增殖功能小鼠脾臟淋巴細胞（4×105個/孔）接種于96孔板，加入不同濃度的受試物，同時加入ConA（終濃度1μg/ml）或LPS（終濃度10μg/ml），另設無刺激劑的本底對照。于37℃，5% CO2培養箱中作用48h，MTT法檢測絲裂原誘導脾淋巴細胞增殖功能。

2.3RT-PCR檢測IL-2、IFN-γ和T-bet mRNA基因表達因表達，用序列單環己基銨ed ymmunomodulatin-脾淋巴細胞（5×106個/孔）接種于anti-CD3 mAb抗體（5μg/ml）包被的24孔板中，加入黃芪皂苷II（30nM），另設相應溶媒對照和無刺激本底對照，于37℃，5% CO2培養箱培養16h后，收集細胞，Trizol一步抽提法提取總RNA，反轉成cDNA，PCR檢測檢測IL-2、IFN-γ和T-bet mRNA基因表達，電泳和成像。特異基因引物序列如下：

基因PCR引物序列IL-2：（sense）5-TGAGCAGGATGGAGAATTACAGG-3；（anti-sense）5-GTCCAAGTTCATCTTCTAGGCAC-3；IFN-γ：（sense）5-ATGAACGCTACACACTGCATC-3；（anti-sense）5-CCATCCTTTTGCCAGTTCCTC-3；T-bet：（sense）5-CCAGGAAGTTTCATTTGGGAAGC-3；（anti-sense）5-ACGTGTTTAGAAGCACTG-3；β-actin：（sense）5-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3；（anti-sense）5-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3；2.3統計學分析所有實驗數據均采用統計學方法處理。均值間差異比較采用t檢驗或單因素方差分析，數據統計均以平均值±標準差表示，以P<0.05為顯著水平。數據統計分析采用SPSS17.0統計軟件包。

3實驗結果

3.1黃芪皂苷1對絲裂誘導脾淋巴細胞增殖反應的影響見圖1。結果表明，1μg/mL Con A、10 μg/mL LPS顯著誘導T、B淋巴細胞發生克隆性增殖，黃芪皂苷I 在30nM顯著促進ConA 刺激T淋巴細胞增殖，差異有顯著性意義（P<0.05）。然而對LPS誘導的B淋巴細胞增殖無明顯的影響（P>0.05）。

3.2黃芪皂苷I對IL-2、IFN-γ和T-bet mRNA基因表達的影響見圖2。RT-PCR方法檢測黃芪皂苷 II對IL-2、IFN-γ和T-bet mRNA表達情況。結果顯示，anti-CD3 mAb刺激16h后能夠顯著誘導IL-2、IFN-γ和T-bet mRNA表達，黃芪皂苷 I體外用藥能夠顯著上調IFN-γ和T-bet的mRNA表達，而對IL-2表達水平無明顯影響，說明黃芪皂苷I 在基因轉錄水平可能通過促進T-bet的轉錄而誘導IFN-γ的表達。

4討論

在機體的細胞免疫中T細胞發揮著重要的作用，T淋巴細胞不僅是細胞免疫功能的承擔者，而且也是免疫應答的調節者，其中以輔助性T淋巴細胞（Th）和抑制性T 淋巴細胞（Ts）對免疫網絡的調節作用至為重要，參與多種自身免疫性疾病和腫瘤免疫過程。IFN-γ是Th1型細胞釋放的重要的細胞因子，對Th1細胞的分化起著重要作用，同時其可誘導巨噬細胞誘導型一氧化氮合酶（iNOS）的產生，促進NO的合成，是IFN-γ抗腫瘤作用重要的分子機制之一[6-7]。IFN-γ能活化NK細胞，提高其對靶細胞的殺傷功能。

T 細胞激活后分化發展成為Th1、Th2、Th17和Treg等T淋巴細胞亞群受到不同轉錄因子的調節。T-bet屬于T-box家族的轉錄因子，選擇性表達于Th1細胞，作為Th1特異的轉錄因子能誘導Th1型細胞因子的產生，在Th1細胞的分化中起著決定作用[8]。T細胞激活后產生兩種重要的細胞因子IL-2、IFN-γ，它們對促進和擴大免疫反應有很強的功能。IL-2是T細胞增殖所必需的T細胞生長因子，具有很強的免疫刺激作用和抗腫瘤活性[9]。我們的實驗結果表明，黃芪皂苷I顯著促進anti-CD3 mAb誘導的T淋巴細胞增殖。在mRNA水平上，黃芪皂苷 I 也能夠顯著上調 IFN-γ、T-bet 的mRNA表達水平。研究已證實，黃芪皂苷能夠顯著激活 CD45 PTPase 酶活性。在分子水平，黃芪皂苷能夠顯著促進CD45 PTPase作用底物P56LCK（Tyr505）去磷酸化。基于以上實驗結果，推測黃芪皂苷 I作為CD45 PTPase激活劑，在細胞水平可能通過激活CD45 PTPase，參與TCR介導的T淋巴細胞信號轉導，從而激活下游相關信號通路，引起Th1特異性轉錄因子T-bet轉錄激活，促進T 淋巴細胞增殖和IL-2、IFN-γ的產生。該研究豐富和發展黃芪“健脾補中，益衛固表”功效的科學內涵，為傳統中藥的現代研究提供新的研究思路和方法。

參考文獻：

[1]南京中醫藥大學.中藥大辭典[M].上海：上海科學技術出版社，1986：2038.

[2]Chun-Ping Wan，Li-Xin Gao，Li-Fei Hou，et al.Astragaloside triggers T cell activation through regulating the activity of CD45 protein tyrosine phosphatase[J].Acta Pharmacologica Sinica，2013，（34）：522-530.

[3]萬春平.黃芪皂苷類組分生物活性研究進展[J].云南中醫中藥雜志.2011，32（8）：79-81.

[4]萬春平.黃芪皂苷III通過IFN-γ介導體外免疫調節作用的研究[J].云南中醫中藥雜志.2011，32（9）：69-71.

[5]Wang YP，Li XY，Song CQ，et al.Effect of astragaloside IV on T，B Lymphpcyteproliferation and peritoneal macrophage function in mice[J].Acta Pharmacol Sin.2002，（3），263-266.

[6]Susanne J.Szabo，Brandon M.Sullivan，Stanford L.PengAnnu.Rev.molecul ar mechansism regulating Th1 immune responses.Immunol.2003，21：713-58.

[7]金伯泉.細胞和分子生物學[M].北京：科學出版社，2001：185-186.

[8]Ansel KM，Lee DU，Rao A.An epigenetic View of helper T cell differation[J].Nat Immunol.2003，（4）：616-23.

[9]Tomas Mustelin，Souad Rahmouni，Nunzio Bottini.et al.Role of protein tyro sine phosphatases in T cell activation[J].Immunological Reviews，2003，（191）：13 9-147.

（收稿日期：2017-11-10）