ROCK2在癲癇大鼠海馬區(qū)的表達①

梁 婷,王淑秋

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，黑龍江 佳木斯 154007)

ROCK2在癲癇大鼠海馬區(qū)的表達①

梁 婷,王淑秋

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：探討氯化鋰-匹魯卡品誘導(dǎo)SD大鼠癲癇(epilepsy)急性發(fā)作時，ROCK2蛋白在癲癇大鼠海馬區(qū)的表達情況，進一步闡明癲癇的發(fā)病機制。方法：選取正常雄性SD大鼠30只作為研究對象，模型組擬于腹腔內(nèi)注入氯化鋰-匹魯卡品誘發(fā)癲癇大鼠模型，實驗組擬于腹腔內(nèi)注入wortmannin抑制劑抑制PI3K/Akt信號通路，正常組擬于腹腔內(nèi)注入等量生理鹽水做對照。取材后，采用免疫組織化學(xué)方法檢測大鼠海馬各區(qū)ROCK2的表達，Spass17.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果：(1)與正常組相比,模型組的ROCK2在海馬各區(qū)(CAI區(qū),CA2區(qū),CA3區(qū))呈高表達(P<0.05)。(2)與正常組相比,實驗組的ROCK2在海馬各區(qū)(CAI區(qū),CA2區(qū),CA3區(qū))呈高表達(P<0.05)。(3)與模型組相比,實驗組的ROCK2在海馬各區(qū)(CAI區(qū),CA2區(qū),CA3區(qū))呈低表達(P<0.05)。結(jié)論：(1)癲癇的發(fā)病過程中，ROCK2的異常高表達，提示其參與了癲癇的發(fā)病過程。(2)抑制PI3K/Akt信號通路，ROCK2的表達下降,提示二者之間存在著某些調(diào)控關(guān)系，然其具體機制有待進一步深入研究發(fā)現(xiàn)。

癲癇;SD大鼠;氯化鋰-匹魯卡品;ROCK2蛋白

癲癇是世界性腦部惡疾，其復(fù)雜的病理生理學(xué)機制至今仍不明確。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，癲癇的發(fā)病中存在著神經(jīng)元細胞變形，凋亡，缺失，重塑等形態(tài)學(xué)改變。Rho/ROCK2信號通路在細胞骨架蛋白的合成、降解、移動和收縮及細胞的遷移、增殖和存活等發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用，調(diào)控著細胞骨架及其形態(tài)的異質(zhì)性。本實驗擬以氯化鋁-匹魯卡品誘導(dǎo)SD大鼠癲癇急性發(fā)作模型，wortmannin抑制PI3K/Akt信號通路，通過HE染色及免疫組化觀察大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細胞形態(tài)學(xué)并監(jiān)測其ROCK2的表達情況。探討癲癇急性發(fā)作時，阻斷PI3K/Akt信號通路對ROCK2的表達是否有影響，初步揭示PI3K/Akt與Rho/ROCK2信號通路在癲癇發(fā)作過程中的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑及儀器

正常雄性SD大鼠(購自佳木斯大學(xué)動物中心);ROCK2多克隆兔抗鼠抗體為(Santa生物技術(shù)公司);羊抗兔二抗(博士德公司)，即用型SABC免疫組化試劑盒(博士德公司)、DAB顯色劑(博士德公司);石蠟包埋機(俊杰電子有限公司)、切片機(俊杰電子有限公司)、恒溫水浴箱(保恒恒溫技術(shù)有限公司)、普通光學(xué)顯微鏡(BH-Z日本Olympus公司)。

1.2 分組與給藥

健康雄性SD大鼠30只，體重(170±20)g，24h自由飲食，隨機分為3組(n=10)后，擬以腹部注藥法誘導(dǎo)癲癇大鼠模型。第一天的中午13點鐘測大鼠體重，開始給予各組大鼠相應(yīng)藥物注射。(1)對照組：將等量生理鹽水以相同于實驗組、模型組的各時間點、注射部位、注射方法、用藥劑量進行處理。(2)模型組：腹腔注入氯化鋰(3mmol/kg)預(yù)處理，19h后注入與wortmannin等量的生理鹽水,1.5h后皮下注入硫酸阿托品(1mg/kg),再0.5h后腹腔注入匹魯卡品(80mg/kg)。(3)實驗組(wortmannin抑制劑組)：腹腔注入氯化鋰(3mmol/kg)預(yù)處理,19h后腹腔注入wortmannin(1mg/kg)，1.5h后皮下注入硫酸阿托品(1mg/kg),再0.5h后腹腔注入匹魯卡品(80mg/kg)。按Racine分級[1]判斷模型是否制備成功。如果大鼠無癲癇發(fā)作或發(fā)作未至Ⅳ級標(biāo)準(zhǔn)，可以每隔30min再次腹腔注入匹羅卡品1次，最大注射劑量不超過60mg/kg。癲癇發(fā)作1h后根據(jù)分組情況腹腔注入 10%水合氯醛(350mg/kg)控制發(fā)作，正常組代以等量生理鹽水。30min后仍有發(fā)作者，行原劑量二次注入1次。終止發(fā)作6h后取材。

1.3 取材與標(biāo)本制備

癲癇發(fā)作終止6h后，給予10%水合氯醛(0.4mL/kg)過量麻醉大鼠，掐尾部無反應(yīng)表示麻醉成功。俯臥位將大鼠固定于操作臺上，眼科剪刀開胸后分離心包，于左心室動脈導(dǎo)管尖端心尖部行主動脈插管，后剪開右心耳。勻速注入0.9%生理鹽水約50mL，待心耳開口處流出透明色生理鹽水時改換為4%多聚甲醛行灌流固定，若大鼠呈現(xiàn)抽搐即停止固定。隨后，于冰上將大鼠開顱取腦，并置于多聚甲醛溶液中再次固定。48h后將腦組織行石蠟包埋，切片機行冠狀連續(xù)切片，切至所需海馬組織，每例連續(xù)切片15張，厚度為5μm，充分展片于防脫載玻片上，置入恒溫烘干箱中拷片2h，取出后無灰塵存放，每例隨機抽取6張切片分別進行HE及免疫組化實驗。

1.4 組織學(xué)觀察

①HE染色 將切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，伊紅-蘇木素染色，梯度酒精透明透明，封片。鏡下觀察各切片海馬區(qū)細胞結(jié)構(gòu)。②免疫組化 將切片行二甲苯脫蠟，酒精脫水，枸櫞酸鹽溶液微波熱修復(fù)，適量BSA封閉后37℃孵育，隨后加ROCK2一抗4℃冰箱過夜，次日依次加入二抗、SABC、DAB顯色劑后，經(jīng)復(fù)染，風(fēng)化，透明后封片。電鏡下監(jiān)測海馬各區(qū)神經(jīng)細胞中ROCK2的表達(一抗的陰性對照為PBS)。各標(biāo)本隨機取5張切片，分別隨機取5個不重復(fù)的視野，對陽性細胞進行計數(shù)，取均值作為該標(biāo)本結(jié)果，以每組5例樣本觀察結(jié)果的均值作為該組的實驗結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)觀察 除正常組組外，其余大鼠基本達到Ⅳ級以上癲癇發(fā)作水平。且持續(xù)發(fā)作30 min 以上，癲癇模型組大鼠不明原因死亡2只，未達發(fā)作標(biāo)準(zhǔn)2只，均行隨機替補，共計造模成功16只，成功率為80%。

2.2 HE染色結(jié)果 可見正常組大鼠海馬各區(qū)多層神經(jīng)元緊密排列，胞體、胞核、核仁均正常。模型組與實驗組大鼠海馬神經(jīng)元密度降低、排列散亂，形態(tài)不規(guī)則，胞體縮小、可見神經(jīng)元間隙明顯增寬，部分神經(jīng)元細胞胞核高度染色、固縮甚至消失；神經(jīng)元嚴(yán)重變形、變性、壞死。見圖1。

正常組(×400)

模型組(×400)

實驗組(×400)

圖1 各組大鼠海馬區(qū)域神經(jīng)元細胞HE染色結(jié)果

2.3免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

可見各實驗分組中，在海馬區(qū)神經(jīng)元細胞的胞漿、胞膜和胞核中，ROCK2均有不同程度的表達(棕黃色顆粒者)。對比正常組，模型組與實驗組中表達ROCK2的陽性細胞數(shù)均顯著增多(P<0.05),提示其參與了癲癇的發(fā)作；當(dāng)特異性的抑制PI3K/AKT信號通路之后，對比模型組，實驗組中表達ROCK2的陽性細胞數(shù)有所下降(P<0.05),表明ROCK2可能為PI3K/AKT信號通路的下游信號分子。見圖2、圖3。

正常組(×400)

模型組(×400)

實驗組(×400)

圖2 各組大鼠海馬區(qū)域神經(jīng)元細胞ROCK2的表達情況

圖3 ROCK2蛋白在各組在鼠海馬區(qū)的表達量

注：與正常組相比，ROCK2高表達，#P<0.05，差異性明顯；與模型組相比，ROCK2的表達有所下降，*P<0.05，差異性明顯。

3 討論

以往研究表明，同為細胞骨架蛋白的Rho/Rho激酶和GFAP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活后，軸突生長錐塌陷，軸突的生長、再生過程被抑制，導(dǎo)致癲癇發(fā)作[2]。神經(jīng)元肌動蛋白穩(wěn)定性下降，軸突生長錐體積增加延長，這一變化在Rho激酶的活性受抑制之時表現(xiàn)尤為突出[3]。PI3K/Akt[4]與MEK/ERK1/2[5]均為人體內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)通路，促進神經(jīng)元的存活并具有肯定的抗凋亡作用。本研究發(fā)現(xiàn)：在模型組與實驗組中，ROCK2均呈現(xiàn)顯著性高表達，提示其參與了癲癇的發(fā)病過程；同時當(dāng)實驗組中PI3K/Akt信號通路被抑制時，相比較模型組，ROCK2的表達有所下降，提示在癲癇的發(fā)病過程中，其可能為PI3K/Akt通路的下游信號分子。然而新近證實PTEN(一種磷酸酶)為ROCK的一種底物，可以通過ROCK而被激活，同時其為PI3K上游區(qū)域的一個負性調(diào)節(jié)蛋白，與細胞生長調(diào)節(jié)，蛋白質(zhì)合成，轉(zhuǎn)錄子調(diào)節(jié)及細胞存活有關(guān)[6]。在HEK細胞中，ROCK激酶活性增高可通過PTEN介導(dǎo)而降低Akt蛋白的磷酸化[7]。有文獻表明，ROCK抑制劑通過削弱缺血再灌注引起的Bcl-2下調(diào)及激活PI3K/Akt/eNOS途徑來發(fā)揮保護心臟的功效，這種保護作用可以被PI3K抑制劑 LY294002完全阻斷；在內(nèi)皮細胞，PI3K激活蛋白酶Akt，導(dǎo)致NO產(chǎn)生，起到擴張血管的作用[8]，同時內(nèi)皮細胞的ROCK通過抑制PI3K來減少NO產(chǎn)生，而對后者的抑制作用更顯著[9]。由此可見，PI3K/Akt信號通路與Rho/ROCK2信號通路之間存在著復(fù)雜的正負反饋調(diào)節(jié)環(huán)路。然而，在癲癇的發(fā)病過程中是否也存在著這一復(fù)雜的調(diào)節(jié)環(huán)路，有待進一步研究發(fā)現(xiàn)，這為后續(xù)研究癲癇的發(fā)病機制提供了新的思路。

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佳木斯大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項目，編號：LM2015_009。

梁婷(1989～)女，山西呂梁人，在讀碩士研究生。

王淑秋(1957～)女，黑龍江佳木斯人，學(xué)士，教授，博士研究生導(dǎo)師。E-mail:Wang_shuq@163.com。

R742.1

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1008-0104(2017)06-0071-03

2016-11-25)