HPLC法測定鹽酸林可霉素注射液中林可霉素的含量

包愛情，陸春波，林仙軍，陳曉林，蔡文金

(浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州 311101)

HPLC法測定鹽酸林可霉素注射液中林可霉素的含量

包愛情，陸春波，林仙軍，陳曉林，蔡文金

(浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州 311101)

建立并驗證了高效液相色譜法測定鹽酸林可霉素注射液中林可霉素含量的方法。試驗采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以0.02 mol/L磷酸氫二銨-乙腈(75∶25,V/V)為流動相，流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃，波長為214 nm。試驗結(jié)果表明林可霉素在0.1～4.0 mg/mL范圍內(nèi)線性良好，R2=1.0000，平均回收率為98.7%(n=9)，RSD為0.8%。與《中國獸藥典》2015年版一部收載的方法相比，本研究開發(fā)的方法優(yōu)化了流動相，流動相含鹽量大大降低，林可霉素峰形更尖銳，理論板數(shù)更高。本方法簡便、準確、可靠，可用于鹽酸林可霉素注射液的質(zhì)量控制。

鹽酸林可霉素注射液；含量測定；高效液相色譜法

林可霉素屬于林可胺類抗生素，主要作用于細菌核糖體的50s亞基，抑制肽鏈延長，干擾細菌蛋白質(zhì)合成，屬生長期抑菌劑。鹽酸林可霉素注射液屬于人畜共用藥，對人與動物的革蘭氏陽性菌和支原體感染都有較好的作用[1]。獸用鹽酸林可霉素注射液，收錄于《中國獸藥典》2015版一部[2]，其中采用高效液相色譜法對含量和有關(guān)物質(zhì)進行測定。但該方法使用的流動相為0.05 mol/L硼砂溶液(用85%磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值至5.0)-甲醇-乙腈(67∶33∶2,V/V)，該流動相中使用了高濃度的硼砂溶液，在流動相配制時硼砂溶解需要較長的時間，且高濃度的鹽溶液對色譜柱和液相系統(tǒng)都有較大的損害，長期處于高濃度的鹽溶液中，將大大縮短色譜柱和儀器壽命[3]。同時該流動相下林可霉素峰形有前沿現(xiàn)象，峰寬過大容易干擾有關(guān)物質(zhì)的測定。已經(jīng)發(fā)表的文獻中已經(jīng)有較多涉及到對林可霉素的定量，化學(xué)發(fā)光法[4-5]、酶聯(lián)免疫法[6-8]、毛細管色譜法[9]、氣相法[10]、氣質(zhì)法[11]、液質(zhì)法[12-13]和液相法[14-15]等方法，但其中液相法多采用不同濃度的硼酸溶液作為流動相。開發(fā)一種新的液相方法來改善以上問題，既可以提高檢測效率，又可以延長儀器和耗材壽命。本文改進了流動相，開發(fā)了高效液相色潽法測定鹽酸林可霉素注射液含量的方法，并對方法進行了驗證。

1 材 料

1.1 儀器 Aglient 1260 高效液相色譜儀，配安捷倫二極管陣列檢測器，美國Aglient公司； XS-205電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；KQ-500E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試劑與材料 甲醇、乙腈為色譜純，Merck KGaA 公司，其余試劑均為分析純；實驗用水為milli-Q超純水。林可霉素對照品(來源：中國食品藥品檢定研究院，批號：130432-201510，含量：85.5%)；鹽酸林可霉素注射液供試品(批號分別為20161201、20161202、20161203，規(guī)格10 mL∶1 g)，由浙江某廠生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18 XDB(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流動相：0.02 mol/L磷酸氫二銨-乙腈(75∶25,V/V)；流速1.0 mL/min；溫度30 ℃；檢測波長214 nm；進樣量10 μL。在此色譜條件下，對照品溶液和供試品溶液的色譜圖見圖1。在《中國獸藥典》2015年版一部中的條件下對照品色譜圖見圖2。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取林可霉素對照品100 mg，置25 mL棕色容量瓶中，加流動相約20 mL，超聲5 min，冷卻至室溫，用流動相稀釋至刻度，作為對照品儲備液(約4 mg/mL)。精密量取適量，用流動相稀釋成2 mg/mL的對照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密量取鹽酸林可霉素注射液適量，用流動相定量稀釋制成每l mL中含林可霉素2 mg的溶液，搖勻。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性范圍 精密量取對照品貯備液(約4 mg/mL)適量，用流動相稀釋成0.1，0.2，0.5，1，2 mg/mL的系列對照品溶液，按上述色譜條件，精密量取10 μL，注入色譜儀，記錄色譜圖，測定峰面積，以峰面積積分值(Y)對濃度(X，mg/mL)進行線性回歸計算，方程為：Y=2209.4X-18.7(R2=1.0000)，線性范圍0.1～4.0 mg/mL。結(jié)果表明在線性范圍內(nèi)，林可霉素濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3.2 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μL，按上述色譜條件，連續(xù)重復(fù)進樣6次，記錄峰面積，計算結(jié)果，林可霉素峰面積的RSD為0.4%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液(批號20161202)，分別在0、1、2、4、6、8、12、24 h進樣10 μL，記錄色譜峰面積，林可霉素峰面積的RSD為0.7%。結(jié)果表明供試品溶液在室溫下放置24 h穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗 取同一批供試品(批號20161202)，照2.2.2項下方法制備供試品溶液，測定供試品溶液中林可霉素的含量。結(jié)果測得林可霉素的峰面積分別為4592.1、4598.1、4569.3、4589.1、4536.1和4578.1，RSD為0.5%，表明方法重復(fù)性良好。

圖1 優(yōu)化條件下(A)對照品色譜圖和(B)供試品色譜圖(批號為20161202)Fig 1 Chromatograms of (A) the reference substance and (B) the sample(lot munber:20161202) under optimized conditions

圖2 《中國獸藥典》2015版條件下對照品色譜圖Fig 2 Chromatogram of the reference substance under conditions of Chinese veterinary pharmacopoeia 2015

2.3.5 加樣回收率試驗 準確量取已知含量的鹽酸林可霉素注射液(批號20161202，規(guī)格為10 mL∶1 g，含量為103.6 mg/mL)250 μL，共9份，置25 mL量瓶中，按高(120%)、中(100%)、低(80%)三個濃度水平分別添加林可霉素對照品，制得向已知含量制劑中添加已知測定物的添加樣品，每個濃度水平的添加樣品分別制備3份供試樣。用流動相溶解并稀釋至刻度，測定并計算回收率，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果表(n=9)Tab 1 Results of recovery test (n=9)

2.3.6 耐用性 在優(yōu)化的色譜條件下，比較了Waters Symmetry C18(4.6 mm×250 mm)和Aglient Eclipse XDB C18 (4.6 mm×250 mm)色譜柱，結(jié)果表明,兩者均能使林可霉素峰形尖銳；對溫度進行了考察，在本文優(yōu)化的流動相下選擇溫度為25 ℃和35 ℃時，除出峰時間發(fā)生變化外，其余變化很?。粚⒘鲃酉嗨嗪陀袡C相比例調(diào)整為78∶22和72∶28進行測試，結(jié)果表明，流動相比例的微調(diào)也僅能影響出峰時間，對峰形和理論塔板數(shù)影響甚小。不同品牌的色譜柱、不同流動相有機相與水相比例以及不同溫度，均能滿足試驗需要，方法耐用性較強。

2.4 實際樣品測定 取不同批號的鹽酸林可霉素注射液，按2.2.2項下方法處理，按上述色譜條件進行測定，每個樣品制備2份，計算樣品中林可霉素的含量，取平均值。同時與《中國獸藥典》2015年版一部比較結(jié)果(表2)。

表2 樣品含量測定結(jié)果(標示量/%，n=2)Tab 2 Results of content determination of samples (labelled amount/%, n=2)

3 討論與小結(jié)

在波長選擇上，由于林可霉素在200 nm左右有最大吸收波長，但該處容易受溶劑干擾，因此本文沿用《中國獸藥典》中的214 nm作為檢測波長。

在流動相優(yōu)化上，本文嘗試了《中國獸藥典》2015年版一部中的流動相，水-乙腈(75∶25,V/V)，水-甲醇(65∶35,V/V)，0.02 mol/L磷酸氫二鉀(用85%磷酸調(diào)節(jié)pH至6.1)-乙腈(75∶25,V/V)，以及0.01 mol/L磷酸氫二銨-乙腈(75∶25,V/V)，上述流動相體系除最后一種外，其余均導(dǎo)致林可霉素峰形差；而最后一種則在峰形略差于本文選擇的流動相，經(jīng)過優(yōu)化，選擇了本文開發(fā)的流動相。由于《中國獸藥典》中的流動相使得林可霉素峰有前沿現(xiàn)象，經(jīng)優(yōu)化后有很大改善，理論板數(shù)也由6245增加到10239，分離性能更好。

使用本文開發(fā)的方法與《中國獸藥典》2015年版一部方法進行比較，結(jié)果表明兩者在測定鹽酸林可霉素注射液含量時，結(jié)果基本一致。方法使用了常用的溶解性好的磷酸氫二銨作為水相的溶質(zhì)，且配制流動相時不需要調(diào)pH，在配制流動相時縮短了時間，提高了檢測效率，且低濃度鹽溶液有利于儀器的長期使用。

本文開發(fā)的方法簡便、準確、重現(xiàn)性好，能夠有效的控制該產(chǎn)品的質(zhì)量，為產(chǎn)品標準改進提供了研究基礎(chǔ)。

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ContentDeterminationofLincomycininLincomycinHydrochlordeInjectionbyHPLC

BAQ Ai-qing, LU Chun-bo, LIN Xian-jun, CHEN Xiao-lin, CAI Wen-Jin

(ZhejiangProvinceInstituteofVeterinaryDrugandFeedstuff,Hangzhou311101,China)

The method for content determination of lincomycin in lincomycin hydrochlorde injection by HPLC was developed and validated. Analysis was performed on a C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) with a mobile phase of 0.02 mol/L diammonium phosphate aqueous solution-acetonitrile (75∶25,V/V) at a flow rate of 1.0 mL/min and a column temperature of 30 ℃. The determination wave length was 214 nm. The results showed that a good linear relationship was accepted in the range of 0.1～4.0 mg/mL (R2=1.0000), and the average recovery was 98.7% (n=9)withRSDof 0.8%. In contrast with method in Chinese veterinary pharmacopoeia 2015, the mobile phase was optimized by reducing salinity while the peak shape and number of theoretical plates of lincomycin were improved. This method was convenient, accurate, reliable and was suitable to control the quality of lincomycin hydrochlorde injection.

lincomycin hydrochlorde injection; content determination; high performance liquid chromatography (HPLC)

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.12.09

2017-03-21

A

1002-1280 (2017) 12-0047-05

S859.83

包愛情，從事獸藥檢測工作。E-mail：baoaiqing@126.com

(編輯：侯向輝)