VICH血藥法生物等效性指導原則概述

蘇富琴，徐 倩，梁先明*，曹興元

(1中國獸醫藥品監察所 北京，100081；2中國農業大學動物醫學院 北京，100193)

VICH血藥法生物等效性指導原則概述

蘇富琴1，徐 倩1，梁先明1*，曹興元2*

(1中國獸醫藥品監察所 北京，100081；2中國農業大學動物醫學院 北京，100193)

VICH是指獸藥注冊技術要求國際協調合作組織。血藥法生物等效性試驗是獸藥等效性研究的重要方法。VICH血藥法生物等效性指導原則介紹了除多次采血困難的靶動物(如蜂、魚)的動物血藥法生物等效性的實驗試驗建議，使基本藥代動力學試驗、生物等效性試驗設計和統計分析原則等在VICH地區得到互認。該指導原則2016年8月開始實施。

獸藥注冊技術要求國際協調合作組織；藥代動力學；生物等效性；獸藥

生物等效性(bioequivalence，BE)是指在相同試驗條件下，藥學等效制劑或給予相同摩爾數的藥物，其活性成分吸收程度和速度的差異無統計學意義，臨床療效相等，臨床應用上制劑可換。通常意義的BE 研究是指用生物利用度(Bioavailability，BA)研究方法，以藥代動力學參數為終點指標，根據預先確定的等效標準和限度進行的比較研究。

為了避免不必要的重復試驗，統一獸藥注冊資料中生物等效性報告要求， VICH于2015年8月通過獸藥生物等效性(血藥法)指導原則[1]，2016年8月起實施。該指導原則包括適用范圍、制定BE試驗方案的因素/變量、統計學分析和術語四部分。

1 適用范圍

BE不僅適用于仿制藥與原研藥的比較，判斷仿制藥是否可與原創藥替換使用，還適用于新藥不同研發階段的橋接試驗，如處方工藝改變、劑型改變(如膠囊和片劑)、給藥途徑改變等的效果對比等。本指南不包括：①BE豁免情況；②微生物發酵產品；③治療用預混劑；④以藥理學為終點的研究；⑤以臨床為終點的研究；⑥體外溶出試驗；⑦食品安全；⑧血藥濃度與作用位點的藥物濃度無相關性的藥物(如乳房注入劑)；⑨支持性應用研究(如適口性)；⑩多次采血困難的靶動物(如蜂、魚等)。

2 制定BE試驗方案的因素/變量

VICH要求BE的實施必須遵守良好實驗室操作規范(Good Laboratory Practices，GLP)。而我國獸藥將BE歸為良好臨床操作規范(Good Clinical Practices，GCP)。

試驗設計根據藥物和靶動物的不同特點而選擇科學合理的設計方案。

2.1 試驗設計方案要點 血藥法BE設計首選雙周期雙序列交叉試驗，不滿足首選條件時選擇平行試驗設計，其他設計如重復試驗設計、序貫試驗設計、3-處理交叉試驗設計或多個參比平行設計等。標準的雙周期雙序列交叉試驗設計(2×2)見表1。該試驗設計可以消除試驗變異的主要來源，如不同個體的藥物吸收速率差異、消除差異和分布容積差異。雙序列可以消除潛在的周期效應干擾。兩個周期之間要保證足夠長的清洗期，周期1和周期2 的基線濃度應基本相同。

表1 雙周期雙序列交叉試驗表Tab 1 Two-period, two-sequence, crossover test

平行試驗設計適用于①藥物原形和/或其代謝物導致動物的生理學特征改變(如肝藥酶被誘導，血流量改變)進而導致周期2 的制劑生物利用度發生改變；②藥物原形和/或代謝產物的消除半衰期很長，或呈波動藥動學特征(如flip-flop動力學)；③雙周期交叉試驗中清洗期過長導致動物生理狀態顯著改變；④動物的循環血量較少，采集血液檢測藥物濃度較難持續到周期2。

如果標準2×2 交叉試驗設計較難實施，可考慮采用3 周期重復(部分重復，如參比制劑在所有試驗動物處理兩次)或4 周期重復(完全重復)試驗設計方案。

序貫試驗設計也適用于等效試驗。在實施序貫試驗時，可以先對一定數量的試驗動物進行一次BE試驗并進行期中分析，再采用一定數量的動物繼續進行下一次BE試驗，最后匯總兩次BE試驗數據進行統計學分析并判定是否等效。序貫試驗必須保證總的I 類錯誤符合要求，并在試驗開始前確定終止試驗的標準。在設計方案中需要預先定義每一階段BE試驗所用的動物數量及每次數據分析調整的顯著性水平α值。

2.2 藥物制劑的相關要點 藥物制劑包括受試制劑和參比制劑，均應為官方批準的合法生產的最終上市產品，應含有相同的活性成分(API)。在實施BE前要進行含量測定，不同批次間的受試制劑與參比制劑的含量差異應在±5%之內。實施BE前，應明確受試制劑的關鍵質量特征(如溶出度)。

2.2.1 給藥途徑及給藥部位 受試制劑和參比制劑應采用相同的給藥途徑和給藥部位。參比制劑如果存在多種給藥途徑，應分別實施不同給藥途徑的BE試驗。

2.2.2 給藥劑量 在交叉試驗中，每個受試動物接受的受試制劑和參比制劑的總劑量是相同的，極少數情況，由于動物生長過快導致個體間藥物的體內過程差異過大，給藥劑量也可調整。BE試驗中動物給藥劑量不是采用API的含量實測值，而是標簽用量。一般采用標簽最高劑量，大多數藥物即可確定受試制劑和參比制劑之間的差異。如果在標簽標示范圍內藥動學特征(PK)呈線性，也可采用標簽低劑量。例外情況，如果某一批次的參比制劑與受試制劑含量差異超過5%，給藥劑量可以進行歸一化，但歸一化需要在試驗方案中預先定義。血藥濃度低的藥物，為了達到有效的可測藥物濃度，允許超過標簽最高劑量給藥，但一般不應超過3倍，前提是藥物的安全范圍較寬且PK呈線性。對于標簽范圍內PK不呈線性的參比制劑，應考慮：①如果有證據表明藥物存在飽和吸收過程，限制了API的吸收，則可能會出現標簽高劑量等效而標簽低劑量不等效，此時要優先選擇標簽低劑量，并提供低劑量選擇依據和PK的線性范圍。②如果API溶解性較低，超過標簽劑量范圍后存在非線性PK，則標簽高劑量和標簽低劑量的BE試驗均應實施。

2.2.3 單次給藥vs多次給藥 大多數情況，速釋制劑(immediate-release drug products，IR)和控釋制劑(modified-release drug products，MR)，均可選擇單次給藥藥動學試驗方案，因為單次給藥對于評價API從制劑中釋放進入到循環系統的差異更為靈敏。對于重復給藥的緩釋制劑(extended release formulations，ER)，如果每次給藥無蓄積效應或蓄積效應可忽略不計，可進行單次給藥的BE試驗。如果存在蓄積效應(如穩態血藥濃度超過單次給藥的2 倍)，BE試驗應基于多次給藥試驗設計。存在衡量消除過程(即零級代謝動力學)的藥物，單次給藥血藥濃度太低致使檢測方法無法獲得完整的AUC信息的藥物，也要采用多次給藥試驗設計。除了評價Cmax和AUC，還要重點評價谷濃度(Ctrough)。單次和多次給藥方案均可采用平行或交叉試驗設計。由于較長的試驗周期增加了試驗的復雜性，因此不建議序貫試驗設計和重復試驗設計用于多次給藥的試驗。

2.3 試驗動物和動物種屬的相關要點 動物種屬 BE試驗必須使用靶動物。為了注冊單獨用于特定靶動物的仿制藥，必須根據參比制劑標簽中的每一種主要靶動物單獨進行BE試驗，在主要種屬動物證實生物等效的結果可以外推到標簽中的次要種屬動物，此時還應有科學數據支持外推結果，例如，要考慮動物的解剖和生理特點，制劑API的性質和劑型等。

2.3.1 分組 動物應隨機分組，每個序列(交叉設計)或每個處理組(平行設計)的動物數應相等。實施BE試驗應采用健康動物。對于平行試驗設計，試驗動物潛在影響API藥動學特征的因素盡可能均衡，如體重、性別、營養、生理狀態、繁殖水平(如果相關)等。

2.3.2 膳食狀態 所有種屬動物的膳食狀態和飼喂時間均應符合動物福利(如反芻動物不能禁食)和API的藥動學特征。犬貓用的內服制劑，均應禁食空腹進行BE試驗，除非參比制劑標簽中明確標示僅用于飼喂后動物。給藥前至少禁食8 h，給藥后禁食4 h。對于用于非反芻動物的口服速釋制劑，正常情況下，BE試驗應在空腹和進食兩種狀態下進行，除非有其他證據。試驗方案和報告應闡明在飼喂或禁食狀態下開展BE試驗的合理性，并且要描述飲食和飼料配方。

2.3.3 動物數量(樣本容量) 預實驗有助于估計正式BE試驗所需的合適樣本容量，樣本容量應在試驗方案中預先說明，所計算的樣本容量是正式試驗的最少動物數量。對于普遍接受的BE試驗，每種制劑處理至少12只動物。對于交叉試驗，每個序列最少為6(n=6)只動物，因此總的數量至少為12(N≥12)只。對于平行試驗，每個處理組不少于12只，因此總數不少于24只。考慮動物的脫落風險(如嘔吐、給藥錯誤、受傷/死亡)，需要增加動物數，以保證統計學分析有效。

2.4 分析中的數據剔除 多種情況下，可能且有必要剔除一個試驗動物的全部或部分數據。如果剔除，要在報告中說明剔除的充分理由，實驗方案應制定好數據剔除規則，以避免偏差，剔除樣本可不進行血樣分析。所有的有效數據均應包含在統計學分析中，不能以統計學理由和藥動學理由剔除數據。例如，某頭動物周期2 的數據被剔除后，周期1 的數據不能對應剔除，也應進行統計學分析。

通常，試驗方案中應有剔除標準，如內服制劑存在嘔吐風險，因嘔吐導致丟失的部分或全部給藥劑量，因此，試驗方案中預先設定與嘔吐有關的數據剔除標準。如剔除標準應寫明①從給藥到發生嘔吐的可接受時間(如胃排空時間，動物的膳食狀態等)。②可接受的因嘔吐導致的藥物損失量。此外，試驗中可選擇在動物嘔吐后重復給藥，其標準也應在試驗方案中預先說明。

2.5 血樣采集方案及PK參數 圍繞Tmax要有足夠的采樣點，以便對Cmax進行可靠的估計。對于非靜脈途徑給藥的藥物，避免首個采樣點為Cmax，采樣時間范圍要保證AUC0-last大于AUC0-∞的80%。消除相對數線性回歸分析時要至少選擇3個采樣點，以準確估計ke，并準確估計AUC0-∞。對于具有較長終末消除半衰期的藥物，BE評價時的AUC值可能小于藥物系統暴露總量(AUC0-∞)的80%(Cmax除外)，此時應保證在整個采樣時間內，藥物已吸收完全。對于多次給藥的BE試驗，pre-dose樣本應在給藥前立即采集，并且建議最后一個采樣點緊鄰給藥間隔末端，以便準確估計AUCτ，采樣必須證明血藥濃度已達穩態。

生物等效性中的PK 參數必須經非房室模型分析方法計算獲得。在單次給藥的BE試驗中，應給出Cmax、Tmax、AUC0-last和AUC0-∞藥動學參數。在多次給藥的BE試驗中，應給出AUCτ、穩態Cmax(Cmax ss)、穩態Ctrough、穩態Tmax(Tmax ss)。控釋制劑也要分析Ctrough。其他參數包括ke、終末消除半衰期和Tlag。如果API 為內源性物質，生物等效性PK 參數的計算應包含基線濃度的修正。

2.6 檢測物質

2.6.1 原形藥/代謝物 一般推薦僅測定原形藥物，因為原形藥物的Cmax比代謝產物能更靈敏地反映制劑間的差異。BE的等效判定基于API 的總藥物濃度(游離藥物+與蛋白結合的藥物)。

2.6.2 非活性前藥 前藥的BE 判定仍依據前藥，而不是代謝物，除非前藥在血漿中濃度過低幾乎無法檢測。如果前藥無法測定，則測定代謝產物。

2.6.3 外消旋體/對映體 外消旋體通常推薦用非手性的檢測方法進行生物樣品測定。若同時滿足以下條件，則需分別測定各對映體：①對映體藥效動力學特征不同；②對映體PK特征不同；③藥效主要由含量較少的異構體產生；④至少有一個異構體在吸收過程呈現非線性特征(隨著藥物吸收速率的變化，對映體濃度比例發生改變)。手性輔料選擇性地改變的一種或全部異構體的吸收過程，也必須采用手性分析方法。如果藥物為單一構型，但在體內存在手性轉化，也需要用手性分析方法。

2.7 生物分析方法的驗證 BE 試驗中的生物分析方法必須經過驗證，方法學驗證部分要包括：濃度范圍和線性、基質效應、定量限、特異性(選擇性)、準確度、精密度、分析物和內標物的穩定性。

3 統計分析要點和等效標準

統計模型和隨機化過程應在試驗方案中預先定義。根據不同的試驗設計采用合適的統計學方法。PK參數進行LN 轉換用于滿足ANOVA 的假設條件，ANOVA 用于分析變異差異有無統計學意義。BE的最好評價方法為雙向單側t檢驗及90%置信區間法。提供AUC0-t、AUC0-∞、Cmax幾何均值、算術均值、幾何均值比值及其90%置信區間(CI)等。參數幾何均值比值的90%置信區間數值，AUC和Cmax 的接受標準為80.00%～125.00%，窄治療窗藥物應根據藥物的特性適當縮小90%置信區間范圍。緩釋制劑的多次給藥BE試驗且存在藥物蓄積時，Ctrough也適用80.00%～125.00% 的等效限標準。

4 結 語

VICH GL52(血藥法生物等效性指導原則)給出了獸藥血藥法BE的基本建議，其基本原則與WHO[2]、FDA/EMA等[3-6]以及CFDA[7]的相同，如試驗設計原則、數據剔除原則、生物樣本采集及處理、統計學原則、等效性判定標準等。特殊特點藥物的設計及要點可參考相關文獻，如高變異性藥物[8]、長半衰期藥物的截尾模型[9]。所不同的是，獸藥的復雜性在于靶動物的多樣性，并且每種靶動物有其獨特的解剖和生理特點，比如，反芻動物形成瘤胃前后生理差異明顯，反芻動物不能禁食，蜂蠶魚無法連續采血，這就使得動物BE因不同種屬靶動物特點而不同。其次，人的BE試驗認為藥物有效性和安全性均等效，動物的BE結果只能說明藥物有效性等效，無法替代安全性，所以與食品安全有關的獸藥殘留消除試驗需要單獨實施。另外，支持性試驗研究如適口性、耐受性試驗也需要單獨進行。再者，VICH要求使用健康靶動物，FDA/EMA和CFDA也要求首選健康志愿者，但在健康人群不能承受藥物不良反應或者患者對藥物的耐受性更好時，要選者患者進行BE試驗[10]。最后，實施BE難度，獸藥要相對簡單，因為靶動物可以標準化管理，也無自主行為，而人群的不受控因素例如吸煙、飲酒、自主服用藥物/保健品、使用避孕藥等，數據脫落的幾率更大。VICH血藥法生物等效性指導原則為我國獸藥仿制藥注冊和比對試驗的實施提供了參考。

[1] GL52-st：Bioequivalence: blood level bioequivalence study for veterinary pharmacetical products[EB/OL].2016.

[2] WHO Working Document Multisource(Generic) Pharmaceutical Products: Guidelines on Registration Requirements to Establish Interchangeability[EB/OL]. 2005.

[3] FDA Guidance for Industry:“Bioavailability and Bioequivalence Studies for Orally Administered Drug Products-General Considerations”[EB/OL]. 2000.

[4] 張逸凡，鐘大放. 歐美國家口服固體制劑生物等效性試驗指導原則的要點和啟示 [J]. 中國新藥雜志，2014,23(13):1501-1505.

Zhang Y F, Zhong D F. Main points inspiration of guidence for Bioequivalence studies of oral solid products in eropean and american countries[J].Chinese Journal of New Drugs. 2014,23(13):1501-1505.

[5] Barbara D, April C B, Dale P C,etal. International guidelines for bioequivalence of systemically available orally administered generic drug products: a survey of similarities and differences[J]. AAPS J. 2013, 15(4): 974-990.

[6] Alfredo G, John G. Bioequivalence requirements in the European Union: Critical Discussion [J]. AAPS J. 2012, 14(4): 738-748.

[7] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典2015年版第四部[S]. 9011藥物制劑人體生物利用度和生物等效性指導原則.

Chinese Pharmacopoeia Committee. Pharmacopeia of China 2015 IV[S]. 9011 Bioavailability and Bioequivalence Studies for Orally Administered Drug Products.

[8] Barbara M D, Dale P C, Beth F,etal. Highly variable drugs: observations from bioequivalence data submitted to the FDA for new generic drug applications[J]. AAPS J. 2008, 10(1): 148-156.

[9] Ethan M S, Barbara M D, Parthapratim C,etal. Use of partial area under the curve metrics to assess bioequivalence of methylphenidate multiphasic modified release formulations. AAPS J. 2012, 14(4): 925-926.

[10] Woo Y S, Wang H R, Yoon B H,etal. Bioequivalence of generic and brand name clozapine in Korean schizophrenic patients: a randomized, two-period, crossover study[J]. Psychiatry Investig. 2015 ,12(3):356-360.

OverviewofVICHGuaidlineofBioequivalence:BloodLevelBioequivalenceStudyforVeterinaryPharmaceticalProducts

SU Fu-qin1，XU Qian1，LIANG Xian-ming1*，CAO Xing-yuan2*

(1.ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China; 2.ChinaAgricultureUniversity,Beijing100084,China)

LIANGXian-ming,E-mail：lxm990@163.com;CAOXing-yuan,E-mail：cxy@cau.edu.cn

VICH is the abbreviation of International Cooperation on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Veterinary Medicinal Products.Blood level bioequivalence study is one of the key methord in veterinary medical comparison test. We summerized the key points of the VICH Guaidline of Bioequivalence: blood level bioequivalence study for veterinary pharmacetical products. The basic pharmacokinetics (PK), study design considerations and statistical principles have been described in detail in order to unify the harmonized guideline in the global veterinary community. Animal species from which multiple blood sampling is difficult (e.g., fish, honeybee etc.) are outside the scope of this guideline which is implemented from August 2016.

International Cooperation on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Veterinary Medicinal Products (VICH)； pharmacokinetics；bioequivalence(BE)；veterinary pharmacetical products

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.12.11

2017-00-00

A

1002-1280 (2017) 12-0057-05

S851.66

蘇富琴，副研究員，從事藥理學及毒理學方面研究。

梁先明，E-mail：lxm990@163.com;曹興元，E-mail：cxy@cau.edu.cn。

(編輯：陳希)