超高效液相色譜-串聯質譜法快速測定禽蛋中氯霉素、氟苯尼考及其代謝物殘留

曾 勇，董文婷，龔 波，周 青，金 靈

(湖北省獸藥監察所，武漢 430070)

超高效液相色譜-串聯質譜法快速測定禽蛋中氯霉素、氟苯尼考及其代謝物殘留

曾 勇，董文婷，龔 波，周 青，金 靈

(湖北省獸藥監察所，武漢 430070)

建立了快速測定禽蛋中氯霉素、氟苯尼考及氟苯尼考胺的超高效液相色譜-串聯質譜分析方法。禽蛋用乙腈提取后，正己烷液液萃取除脂，濃縮后超高效液相色譜分離，以乙腈和10%甲醇水為流動相進行梯度洗脫，MRM反應監測模式檢測。結果表明在5～200 μg/L的系列濃度范圍內均呈良好線性關系，相關系數均大于0.999。氯霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺的檢測限為0.5 μg/kg，定量限為2.0 μg/kg，在2～20 μg/kg添加濃度范圍內平均回收率為60%～100%，精密度小于20%。該方法方便快捷、定性準確，適于禽蛋中的氯霉素、氟苯尼考及氟苯尼考胺藥物殘留檢測。

禽蛋；氯霉素類藥物；殘留；超高效液相色譜-串聯質譜

禽蛋是人們日常生活中重要的優質食品，特別是雞蛋的蛋白質含量高，而且富含膽固醇，具有較高的營養價值。但蛋雞飼養密度大，多發疾病，在疾病預防和治療過程中，由于獸醫臨床不遵守休藥期使用，極易造成雞蛋中的藥物殘留，這些殘留會直接損害消費者的健康，還會導致細菌的耐藥性等等。氯霉素類藥物屬于廣譜抗生素，對革蘭氏陽性菌和陰性菌均有抑制作用，氟苯尼考是動物專用抗菌藥，其結構和氯霉素相似，在安全性和有效性方面比氯霉素有明顯優勢，其主要代謝產物為氟苯尼考胺[1]。農業部公告第235號規定氯霉素為禁止使用的藥物，在動物性食品中不得檢出，氟苯尼考為產蛋期禁用藥物，而我國目前國家檢測標準中只涉及水產品、蜂蜜以及動物肌肉組織中氯霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺單個或兩種藥物殘留檢測方法[2-4]，還未建立蛋品中同時檢測氯霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺殘留檢測方法。本方法擬建立禽蛋中氯霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺殘留量的液相色譜-串聯質譜法，以期為禽蛋中氯霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺藥物殘留的監控提供靈敏度高、簡便快速的檢測技術，對獸藥殘留監控具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 液相色譜-串聯質譜儀：配電噴霧離子源Acquity UPLC-Quattro Premier XE 質譜聯用儀，Waters公司；AE260電子天平，Mettler Toledo 公司；冷凍高速離心機，Sigma公司；渦旋混合器；振蕩器；氮吹儀。氯霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺對照品均來自德國DR公司；乙腈為色譜純；甲醇為色譜純；正己烷為分析純；實驗用水為Milli-Q高純水。

1.2 標準溶液配制 精密稱取氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺對照品約10 mg置于100 mL容量瓶中，分別用甲醇溶解并稀釋定容至刻度，此溶液濃度為100 μg/mL標準儲備液。分別準確量取1.00 mL氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的標準儲備溶液于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混勻即得1 μg/mL混合工作液。

1.3 樣品處理 稱取5 g(精確至0.01 g)試樣，置于50 mL塑料離心管，加入10 mL乙腈，于渦旋混合器上渦旋1 min，水平振蕩5 min，以10000 r/min離心10 min，取上清液轉移至另一離心管中，樣品殘渣再加入10 mL乙腈重復提取一次，合并上清液。提取液用10 mL正己烷渦旋混勻，以10000 r/min離心5 min，棄去上層正己烷，下層再用正己烷重復操作一次，取下層乙腈在40 ℃水浴中氮吹至近干，準確加入1 mL水溶解殘渣，渦旋1 min，轉入1.5 mL離心管中，以12000 r/min離心5 min，經過0.22 μm濾膜，供超高效液相色譜-串聯質譜測定。

2 UPLC-MS/MS 分析

2.1 超高效液相色譜條件 色譜柱：waters Xbrige C18柱(3.5 μm，2.1 mm×150 mm)；流動相：A：乙腈，B：10%的甲醇水溶液，梯度洗脫：0～3 min，5%A～40%A，3～4 min，40%A～95%A，4～6 min，95%A～5%A，流速0.3 mL/min；進樣量10 μL；柱溫30 ℃。

2.2 質譜條件 電噴霧離子源 ESI(+)；掃描方式:正離子掃描(氟苯尼考胺)和負離子掃描(氟苯尼考和氯霉素)；毛細管電壓：3.0 kv；離子源溫度：110 ℃；脫溶劑溫度：350 ℃；脫溶劑流量：800 L/h；多反應監測(MRM采集模式)。各種藥物的定性離子對、定量離子對和碰撞能量見表1。

2.3 標準曲線 精密量取一定量的氯霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺混合標準工作液，用空白樣品提取液分別配成濃度為5，10，20，50，100，200 μg/L系列基質標準工作溶液，使用時現用現配。每個濃度重復三次，將測得的峰面積與對應濃度擬合，繪制標準曲線，求回歸方程和相關系數(表2)。

2.4 方法的靈敏度、準確度和精密度 采用空白試樣中添加目標化合物的方法，經實驗得到特征離子色譜峰信噪比大于或等于3的最低濃度為0.5 μg/kg即方法的檢測限。信噪比大于或等10的最低濃度為2.0 μg/kg即方法的定量限。空白禽蛋中添加各藥物后得到的特征離子質量色譜圖如圖1所示。

表1 定性離子對、定量離子對和碰撞能量Tab 1 Qualitative ion pair,quantification ion pair and Collision energy

表2 標準曲線方程Tab 2 Standard curve equation

圖1 空白雞蛋中添加2μg/kg氯霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺的特征離子質量色譜圖Fig 1 Characteristic ion mass chromatogram of chloramphenicol,florfenicol and florfenicol amine 2μg/kg added in blank eggs

在空白禽蛋中添加2.0、4.0、20.0 μg/kg三個不同濃度的藥物進行回收率試驗，每個濃度進行5個平行試驗，重復進行3次，雞蛋結果見表3，鴨蛋結果見表4。本方法在2～20 μg/kg濃度范圍內，添加濃度的回收率為60%～100%。批內相對標準偏差≤20%，批間相對標準偏差≤20%。

表3 雞蛋中添加藥物回收率及精密度測定結果Tab 3 Recovery rate and precision of the drugs added in eggs

表4 鴨蛋中添加藥物回收率及精密度測定結果Tab 4 Recovery rate and precision of the drugs added in duck eggs

3 討論與小結

3.1 提取與凈化 氯霉素、氟苯尼考都是弱極性化合物，而氟苯尼考胺屬于極性化合物，且它們都屬于弱堿性化合物，極易溶于甲醇、乙腈和乙酸乙酯等有機溶劑。國內外關于在動物組織樣品中同時提取氯霉素、氟苯尼考以及氟苯尼考胺大多采用堿化乙酸乙酯。本實驗比較了乙腈、堿性乙酸乙酯、甲醇三種試劑的回收率情況，甲醇回收率較低，禽蛋中加入堿性乙酸乙酯后樣品基質變成果凍狀，無法充分提取。用乙腈能有效提取三種藥物，再用正己烷去除脂肪等雜質，省去了固相萃取步驟，旋轉蒸發，濃縮時用氮氣吹干取代，減少了交叉污染的機會。

3.2 流動相條件 試驗中發現，乙腈和10%甲醇水作為流動相，各組分均能較好分離，并且峰形較好，在質譜上也有較強的響應。而乙腈和0.1%甲酸水作為流動相時，對于正離子模式采集的氟苯尼考胺的信號有明顯增強，因為甲酸對分析物容易質子化而帶上正電荷，然而對于氯霉素和氟苯尼考的負離子采集模式會受到抑制[5]。

3.3 基質效應 對氯霉素類物質殘留檢測文獻中采用的是內標法，本文采用了配制基質曲線法外標定量，用基質空白溶液配制標準溶液，從而降低基質效應。在實驗過程中也考察了基質效應的影響，采用空白雞蛋樣品按照1.3項的提取方法制得陰性空白基質樣液(B)，然后用空白試劑水(A)和空白基質樣液(B)，分別配制2.3項的標準曲線系列溶液，得到標準溶液A和標準溶液B，進行測定，標準曲線見表5。基質效應ME可以用基質曲線斜率/標準曲線斜率×100%來進行計算，一般認為基質效應ME在85%～115%之間不存在明顯基質效應，從表5可以看出，氯霉素和氟苯尼考兩種藥物在乙腈提取制得的空白基質樣液無明顯的基質效應。

表5 氯霉素類化合物標準溶液和基質標準溶液的線性方程和基質效應(ME)Tab 5 Linear equations and matrix effect of chloramphenicol standard solution and matrix standard solution(ME)

3.4 方法的定量限 在方法研究中，氯霉素濃度在0.3 μg/kg時，其S/N為23.6，說明降低氯霉素的定量限空間很大，后續可進一步研究，降低氯霉素的定量限。

本研究建立了禽蛋中氯霉素、氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留檢測的UPLC-MS/MS分析方法，通過對儀器色譜條件和質譜條件各項參數的調諧以及對樣品前處理條件的優化，使得方法的靈敏度、精確度均能滿足獸藥殘留分析。本方法具有操作步驟少、有機溶劑消耗少、測定周期短等優點，而且能同時對氯霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺三種藥物進行多殘留檢測。

[1] Horsberg T E,Martinsen B,Vamma K J.The disposition of 14C-Florfenicolin a tlantie salmon(Salmo Salar)[J].Aquaculture,1994,122:97-106.

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Liu Zh H, Huang Y L, Wang X,etal. Multi-residues determination of Thiamphenicol、Florfenicol、Florfenicol Amine in aquatic products by ELISA[J].Chinese Journal of Veterinary Drug,2010,44(12):1-5.

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Xie K Zh, Yao Y L, Li Y J,etal. Simultaneous detection of Florfenicol and Florfenicol Amine in poultry meat by HPLC-FD[J].Chinese Journal of Veterinary Science,2010,30(4):489-492.

[4] 劉永濤，艾曉輝，李 榮，等.水產品中氟苯尼考和氟苯尼考胺的高效液相色譜熒光法同時測定[J].分析測試學報，2008，27(3)：316-318.

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Sun L, Zhang L,Wang Sh H,etal. A detection of Chloramphenicol and Chloramphenicol metabolites in food by UPLC-MS/MS[J].Chinese Journal of Veterinary Drug,2009,43(3):42-45.

RapidDeterminationofChloramphenicol，FlorfenicolandItsMetabolitesinPoultryEggsbyUPLC-MS/MS

ZENG Yong ,DONG Wen-ting,GONG Bo, ZHOU Qin, JIN Ling

(HubeiInstituteofVeterinaryDrugControl,Wuhan430070，China)

A UPLC-MS/MS method was developed and established to rapidly determine chloramphenicol, florfenicol and florfenicol-amine in poultry eggs. The eggs were extracted with acetonitrile and then separated by n-hexane liquid. After enrichment, the samples were separated by UPLC, elutedwith acetonitrile and 10% methanol as the mobile phase and the MRM reaction was monitored. The results showed that there was a good linearity in the range of 5～200 μg/L ,and the correlation coefficients were more than 0.999. The detection limit of the chloramphenicol, florfenicol and florfenicol-amine was 0.5 μg/kg, and the limit of quantification was 2 μg/kg. The average recoveries were 60%～100% in the range of from 2 μg/kg to 20 μg/kg, and the precision was less than 20%. The method was convenient, rapid, accurate and it was suitable for the detection of chloramphenicol in poultry eggs.

poultry eggs; chloramphenicol; residues; UPLC-MS/MS

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.12.08

2017-06-20

A

1002-1280 (2017) 12-0042-05

S859.84

曾 勇，農業推廣研究員，從事獸藥殘留分析方法研究工作。E-mail: zengyong633@126.com

(編輯：侯向輝)