OPG和RANKL在創傷后異位骨化模型中的表達及作用

馮祁軍 范存義 劉師良 吳可沁 徐龍生

異位骨化是指在正常情況不具有骨化性質的組織中出現骨形成［1］。其嚴重影響患者肢體功能的恢復，包括繼發于肌肉﹑骨骼損傷后的異位骨化，目前尚無理想的預防和治療方法。護骨素（OPG）和核因子-КB受體活化因子配體（RANKL）是調節破骨細胞分化和活性的重要因子，OPG/RANKL系統是調節骨質代謝最后的共同通路［2］。然后，OPG/RANKL系統在異位骨化中的作用尚未明確。本研究通過Michelsson模型［3］誘導新西蘭實驗兔形成異位骨化，并采用免疫組化染色對異位骨化標本中OPG和RANKL的蛋白表達水平進行檢測，探討OPG/RANKL系統在創傷后異位骨化形成機制中的表達與作用。

1 臨床資料

1.1 異位骨化模型的建立 由嘉興學院醫學實驗動物中心提供健康的SPF級雄性新西蘭實驗兔30只，體重為2.5～3.0kg，新西蘭實驗兔適應性喂養1周后，第1天實驗兔用3%戊巴比妥鈉麻醉，首先進行正側位股骨X線攝片確保實驗開始時無異位骨化存在。將30只新西蘭實驗兔隨機分為兩組，模型組20只，對照組10只。模型組每只新西蘭實驗兔每天最大范圍活動膝關節5min，活動后用石膏固定右膝和右踝關節（石膏繃帶制成13～15cm長，10～12層厚，前窄后寬的3/4管狀石膏條帶），右髖關節不固定，石膏干固后將實驗兔放回籠內，單籠飼養，強力按摩與固定操作6d/周，持續5周。對照組10只新西蘭實驗兔不干預，作為空白對照。

1.2 異位骨化標本收集及免疫組化染色 在造模后的第8周，攝右股骨正側位X線片，評價異位骨化的進展及排除骨折等損傷。處死所有實驗兔并快速取出異位骨化組織，收集對照組實驗兔正常的組織標本作為對照。標本經4%多聚甲醛固定，10% EDTA溶液脫鈣7～10d，石蠟整體包埋，做層厚為5μm切片。每個標本取連續的兩張切片鋪于同一塊載玻片上，分別標記為OPG和RANKL，分別用于做OPG 和RANKL免疫組化染色，一抗分別為兔抗兔OPG抗體和兔抗兔RANKL抗體（均購自美國SANTA CRUZ公司）。主要操作步驟：石蠟切片脫蠟水化，高溫抗原修復3min，3%過氧化氫封閉10min，分別滴加OPG和RANKL一抗（稀釋濃度均為1：150），室溫孵育1h，滴加二抗（稀釋濃度為1：200），DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察并判定結果。

1.3 結果判定方法 每例標本切片隨機選取5個高倍視野下進行結果判定，同一載波片上OPG和RANKL染色選取相同位置的高倍視野，按染色強度及陽性細胞數所占百分比進行綜合評分。染色強度：無色計為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞數：＜5%時計為0分，5%～25%計為1分，26%～50%計為2分，＞50%計為3分；染色強度得分與陽性細胞數得分相乘即得出OPG和RANKL蛋白表達水平的綜合評分。取5個高倍視野綜合評分的平均分值作為OPG和RANKL最終的表達水平，并計算OPG平均分值和RANKL平均分值的比值，即為OPG/RANKL比值。

1.4 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。計量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 異位骨化造模結果 對照組10只新西蘭實驗兔全部存活至造模后第8周。模型組20只新西蘭實驗兔中，有2只于造模時因麻醉過量死亡，1只于造模后1周因組織感染死亡，共有18只實驗兔存活至造模后8周。造模后第8周，對照組未見異位骨化形成（見圖1）；模型組存活實驗兔中，共有14只（77.8%）形成異位骨化（見圖2）。

圖1 對照組新西蘭實驗兔右股骨未見異位骨化形成

圖2 模型組新西蘭實驗兔右股骨可見異位骨化形成

2.2 免疫組化結果 對異位骨化組14只異位骨組織標本和對照組的10只正常組織標本進行免疫組化染色，陽性表達著色，陰性對照不著色。標本中OPG和RANKL陽性表達均定位于胞漿內，呈棕黃色，陽性染色細胞主要為成骨細胞和破骨細胞，呈團狀或條帶狀分布，著色強度不一。分別對異位骨化OPG表達水平﹑RANKL表達水平和OPG/RANKL比值分別進行比較，具體結果見表1。免疫組化圖見圖3～6。

表1 異位骨組織中的OPG、RANKL 表達水平比較（）

表1 異位骨組織中的OPG、RANKL 表達水平比較（）

組別 n OPG RANKL OPG/RANKL模型組 14 4.93±0.66 2.89±0.09 1.86±0.27對照組 10 3.49±0.08 3.01±0.16 1.19±0.47 t值 2.268 0.655 2.353 P值 0.012 0.537 0.023

圖3 對照組異位骨組織的OPG 表達（IHC，10×40）

圖4 模型組異位骨組織的OPG 表達（IHC，10×40）

圖5 對照組異位骨組織的RANKL表達（IHC，10×40）

圖6 模型組異位骨組織的RANKL表達（IHC，10×40）

3 討論

異位骨化初期的組織學特征為成纖維細胞活動增加及纖維組織異常增生，繼而出現細胞和血管形成減少，玻璃樣變性形成；最終導致廣泛的鈣質沉積以及新骨形成。骨質重塑的過程主要由破骨細胞與成骨細胞這一成對的﹑相偶聯的細胞活動主導，破骨細胞促使鈣質釋放和骨質吸收，成骨細胞促使鈣質沉積和新骨形成，正常情況下兩者活動維持在一定的平衡水平［4］。

OPG和RANKL均主要由成骨細胞﹑基質細胞產生，在骨骼﹑骨髓以及淋巴組織中的表達水平較高［5］，OPG的主要作用在于抑制破骨細胞的活性及功能，從而下調骨質吸收，促進鈣化過程及骨質形成；RANKL的主要作用為刺激破骨細胞的分化和活性，抑制破骨細胞的凋亡，從而促進骨質破壞和吸收［6］。RANKL主要通過與破骨細胞前體及成熟破骨細胞表面的受體核因子-КB受體活化因子（RANK）結合，刺激破骨細胞的分化﹑活性以及抑制破骨細胞的凋亡；而OPG作為誘餌受體可與RANKL發生競爭性結合，阻止RANKL與其受體RANK的相互作用，從而抑制破骨細胞的分化和活性［7］。因此，OPG/RANKL比值是決定骨質重塑方向的關鍵因素，OPG/RANKL比值降低可促進骨質的破壞和吸收，OPG/RANKL比值升高則可促進鈣質沉積和骨質形成。

OPG/RANKL系統在創傷后異位骨化過程中同樣扮演著重要角色。OPG主要由新生骨組織間成骨細胞表達并與鈣質沉積的部位關系密切，提示OPG可能參與創傷后異位骨化形成過程。本研究對新西蘭實驗兔異位骨化模型組織標本中OPG和RANKL進行檢測，證實了異位骨組織有OPG和RANKL陽性表達，主要位于骨祖細胞﹑成骨細胞﹑成纖維細胞及破骨細胞包漿內。通過對異位骨化組織和正常組織中的OPG和RANKL表達水平進行比較，發現異位骨化組織中的OPG表達水平明顯增加，而且OPG/RANKL的比值也顯著升高。以上結果表明，OPG/RANKL系統可能在異位骨化形成過程中發揮調節作用；OPG的表達增加以及OPG/RANKL比值增加，對異位骨化的形成和發展可能存在促進作用。在各種炎癥細胞和因子的作用下，纖維細胞異常增生，OPG 合成增加及OPG/RANKL比值增加，從而抑制了破骨細胞的分化和活性，使成骨活動得到增強，鈣質沉積和新骨形成增加，最終導致異位骨化的形成。

［1］ Ko JK,Tompson JD,Sholder DS,et al．Heterotopic ossification of the long head of the triceps after reverse total shoulder arthroplasty．J Shoulder Elbow Surg,2016,25(11):1810-1815．

［2］ 仲蕾蕾,楊冰,黃曉斌,等．OPG/RANKL/RANK系統在成骨細胞和破骨細胞相互調節中的作用．中國骨質疏松雜志,2011,17(11):1010-1013．

［3］ Michelsson JE,Granroth G,Andersson LC．Myositis ossificans following forcible manipulation of the leg．A rabbit model for the study of heterotopic boneformation．J Bone Joint Surg Am,1980,62(5):811-815．

［4］ Papadopouli AE,Klonaris CN,Theocharis SE．Role of OPG/RANKL/ RANK axis on the vasculature．Histol Histopathol, 2008,23(4):497-506．

［5］ Boyce BF,Xing L．Functions of RANKL/RANK/OPG in bone model ing and remodeling．Arch Biochem Biophys,2008, 473(2):139-146．

［6］ Kan L,Kessler JA．Evaluation of the cellular origins of heterotopic ossification．Ortbopedics,2014,37(5):329-340．

［7］ Markus C,Kuhn A,Holger S,et al．Scherbaum a,Sven Schinner a Adipocyte-secreted factors increase osteoblast proliferation and the OPG/RANKL ratio to influence osteoclast formation molecular and cellular．Endocrinology,2012,34:180-188．