果膠糖基化改性乳清蛋白工藝優化

蔡 丹，原秀玲，王玉華，修 琳，劉景圣

（吉林農業大學食品科學與工程學院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林長春 130118）

果膠糖基化改性乳清蛋白工藝優化

蔡 丹，原秀玲，王玉華，修 琳，*劉景圣

（吉林農業大學食品科學與工程學院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林長春 130118）

以乳清蛋白為原料，與果膠通過美拉德反應進行干法糖基化改性，研究果膠與乳清蛋白配比、糖基化反應時間和pH值對乳清蛋白膜成膜性的影響。在單因素試驗基礎上，通過正交試驗確定最佳糖基化改性條件。試驗結果表明，當果膠與乳清蛋白質量配比為3∶1，反應時間為76 h，乳化體系的pH值為8.4時，乳清蛋白-果膠產物膜的拉伸強度（TS）為1 247.13±0.29 g，斷條伸長率為31.52%，乳清蛋白-果膠糖基化產物接枝度為49.523%。

乳清蛋白；果膠；糖基化；拉伸強度

乳清蛋白是干酪生產副產物——乳清經過特定工藝而加工得到的一類蛋白質，主要含有α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白、乳鐵蛋白、乳過氧化物酶和許多生物活性因子等[1]，其中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分別占乳清蛋白總量的20%和60%[2]。乳清蛋白作為優質的蛋白質補充劑之一，富含多種人體必需氨基酸，具有營養價值高、易消化吸收、高生物效價等特點[3-4]，因而又被稱為“蛋白之王”。隨著對乳清蛋白研究的不斷深入，其豐富的蛋白質營養價值及良好的功能特性被不斷發掘，目前乳清蛋白已成為保健食品和營養制品生產的重要原料和添加成分，廣泛應用于食品生產中[5-7]。尤其是乳清蛋白可食用膜，已成為國內外學者的研究熱點[8-9]。盡管如此，由于乳清蛋白本身功能特性不夠完善，具有致敏性、β-乳球蛋白的結構等缺陷，這些問題嚴重限制了其應用范圍。因此，近年來國內外研究學者致力于乳清蛋白的改性研究，通過采用物理、化學和生物法對乳清蛋白進行處理[10]，改變乳清蛋白的分子量大小、氨基酸的組成和空間排列構象、電荷分布情況、疏水基團的分布等，從而改善乳清蛋白的功能特性[11]，提高乳清蛋白的利用率和應用范圍。

本研究以乳清蛋白（WPC） 和果膠（P） 為原料，采用干法糖基化改性的方法，使果膠與乳清蛋白發生美拉德反應，改變乳清蛋白的交聯情況，使蛋白膜的結構緊密，以成膜性為考核指標，確定糖基化改性乳清蛋白最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

濃縮乳清蛋白（質量分數79%），希爾瑪乳酪公司提供；果膠，SIGMA-ALDRICH，上海貿易有限公司提供。

1.2 主要儀器與設備

TA-XTplus型食品物性測試儀，英國Stable Micro Systems公司產品；K1100型全自動凱氏定氮儀，濟南海能儀器有限公司產品；0.2型真空冷凍干燥機，沈陽航天新陽速凍設備制造有限公司產品；PHS-3C型pH計，上海精密科學儀器有限公司產品；HPX-9162 MBE型數顯電熱恒溫恒濕培養箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠產品；CP214型電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳清蛋白-果膠干法糖基化方法

首先，將濃縮乳清蛋白溶于去離子水中，用磁力攪拌器迅速攪拌，邊攪拌邊緩慢加入適量的果膠，待充分溶解后，調節pH值，將溶解好的乳清蛋白-果膠混合物進行真空冷凍干燥，得到乳清蛋白-果膠混合物固體樣品。將該樣品放入恒濕培養器內，在一定溫度下，每隔一段時間進行取樣，得到乳清蛋白-果膠糖基化產物。

1.3.2 成膜方法

準確稱取乳清蛋白-果膠糖基化產物配制一定濃度溶液，加入適量的甘油（g/g糖基化產物），脫氣后放入干燥箱中干燥，揭膜后放在恒溫恒濕培養箱中（溫度23℃，相對濕度50%） 平衡48 h，之后對膜的機械性能即拉伸強度（Tensile strength，TS）和斷裂伸長率（Elongation at break，E）進行測定。

1.3.3 乳清蛋白-果膠干法糖基化條件優化

（1）單因素試驗設計。將果膠與乳清蛋白按質量比 （底物配比） 1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1混合，調節pH值為7.0，7.2，7.4，7.6，7.8，8.0，8.2，8.4，8.6，8.8，9.0，冷凍干燥后放置于相對濕度為79%（飽和KBr溶液） 的條件下，反應36，48，60，72，84 h，制備乳清蛋白-果膠糖基化產物，并制備成膜溶液，測定膜的機械性能。

（2）響應面試驗設計。根據單因素的分析結果，各因素對乳清蛋白-多糖糖基化產物膜的TS值和E值的影響是一致的。采用Design Expert（8.0.6） 中Box-Behnken試驗設計方法，建立拉伸強度（TS） 與乳清蛋白-果膠糖基化反應時間、pH值、底物配比的回歸方程，確定乳清蛋白-果膠糖基化產物膜最優制備工藝條件。相同條件下以乳清蛋白獨自成膜為對照組。

1.4 膜機械性能的測定

將在相對濕度50%條件下平衡48 h的膜裁成1 cm×5 cm的條狀后用物性儀測定，條件設定為初始夾距10 mm，拉伸距離45 mm，以3.3 mm/s的速度勻速拉伸，測定后分析膜的拉伸強度和斷裂伸長率。拉伸強度為膜被拉伸斷裂時所受到的拉力最大值，斷裂伸長率為膜被拉伸后長度的增量占原長度的百分比。

2 結果與分析

2.1 乳清蛋白-果膠干法糖基化條件優化單因素試驗結果

2.1.1 不同反應時間對乳清蛋白-果膠膜機械性能的影響

確定反應溫度為60℃，pH值為8，底物配比為3∶1，相對濕度為79%，改變反應時間分別為36，48，60，72，84 h制備乳清蛋白-果膠膜，測定其拉伸強度（TS） 和斷條伸長率（E）。

不同反應時間對WPC-P膜TS和E的影響見圖1。

圖1 不同反應時間對WPC-P膜TS和E的影響

由圖1可知，反應時間會顯著影響（p＜0.05）乳清蛋白-果膠膜的拉伸強度和斷條伸長率，且在試驗設計的時間范圍內，拉伸強度和斷條伸長率的變化呈現一致性。在一定時間范圍內，果膠和乳清蛋白游離氨基的共價結合程度、糖基化程度與反應時間呈正相關，導致成膜過程中糖蛋白分子交聯形成的空間網絡結構逐漸致密；但隨著反應時間的進一步延長，糖蛋白分子的致密空間結構被重新打破，從而引起乳清蛋白-果膠膜的機械性能降低。因而，隨著加熱時間的延長，乳清蛋白-果膠膜的機械性能呈先高后低的趨勢。在反應時間為72 h時，膜的機械性能最優。

2.1.2 不同pH值對乳清蛋白-果膠膜機械性能的影響

確定反應溫度為60℃，反應時間為72 h，底物配比為3∶1，相對濕度79%，改變反應體系的pH值分別為 7.0，7.2，7.4，7.6，7.8，8.0，8.2，8.4，8.6，8.8，9.0，制備乳清蛋白-果膠膜，測定其拉伸強度（TS） 和斷條伸長率（E）。

不同pH值對WPC-P膜TS和E的影響見圖2。

圖2 不同pH值對WPC-P膜TS和E的影響

由圖2可知，反應體系的pH值會顯著影響（p＜0.05） 乳清蛋白-果膠膜的機械性能。當反應體系pH值為8.4時，乳清蛋白-果膠膜的拉伸強度和斷條伸長率達到最大值，之后隨著pH值的不斷升高膜的機械性能呈現逐漸減小趨勢。有文獻[12]表明，自由氨基在酸堿條件下的反應活性不同，在酸性條件下反應活性低，在堿性條件下反應活性較高。本質上，糖基化反應屬于堿催化反應，因此堿性條件下更有利于糖蛋白的結合，但是隨著糖基化反應程度的進一步加大會引起乳清蛋白-果膠膜空間網絡結構等疏松，從而使膜的機械性能降低。

2.1.3 不同底物配比對乳清蛋白-果膠膜機械性能的影響

在溫度為60℃，相對濕度為79%，反應時間為72 h，pH值為8.4的條件下，改變底物配比（果膠/乳清蛋白） 分別為1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1制備WPC-P膜，測定其TS和E。

不同底物配比對WPC-P膜TS和E的影響見圖3。

圖3 不同底物配比對WPC-P膜TS和E的影響

由圖2可知，底物配比會顯著影響（p＜0.05） 乳清蛋白-果膠膜的機械性能。在試驗設計的底物配比范圍內，隨著果膠添加量的增加，乳清蛋白-果膠膜的機械強度呈先升高后降低的趨勢，當底物配比為3∶1時，乳清蛋白-果膠膜的機械性能最高。有研究表明[13]，糖添加比例的升高增加了反應體系中自由氨基與糖分子中羰基之間碰撞和接觸機率，促進了糖蛋白分子直接的交聯，從而提高了膜的機械強度。由于果膠本身溶解度和流動特性的影響，當反應體系中繼續增加果膠的添加比例時，反應體系的黏度增大，分子流動性變差，會影響反應的進行，同時過多的糖蛋白分子交聯會打亂原來有序的空間網絡結構，從而導致膜的機械強度降低。這與華靜嫻等人[14]關于大米蛋白美拉德反應的研究結果一致。

2.2 乳清蛋白-果膠干法糖基化條件響應面試驗設計結果

2.2.1 響應面試驗設計與結果

在單因素試驗基礎上，選取反應時間、反應體系的pH值和底物配比3個因素進行Box-Behnken試驗設計。

響應面分析因素與水平設計見表1，Box-Behnken分析方案及試驗結果見表2，回歸方程的方差分析見表3。

表1 響應面分析因素與水平設計

表2 Box-Behnken分析方案及試驗結果

由表2可知，響應面試驗設計17個試驗。通過用對試驗結果進行的回歸分析及方差分析，得到的回歸方程為：

Y=1 246.52+6.12A+3.23B+2.89C+1.55AB-0.54AC-0.76BC-9.96A2-10.55B2-3.70C2.

由表3可知，回歸方程因變量和自變量之間存在顯著的線性關系（R2=0.993 5），方程p＜0.01，表明此回歸方程極其顯著；其中失擬項p=0.563 8＞0.05，說明此回歸方程對試驗的擬合度較好，證明了試驗設計與方法的可靠性。

2.2.2 各因素間相互作用

表3 回歸方程的方差分析

圖4 兩因素交互作用影響膜拉伸強度值的響應曲面圖及其等高線

兩因素交互作用影響膜拉伸強度值的響應曲面圖及其等高線見圖4。

由圖4可知，反應時間、反應體系的pH值、底物配比都極顯著地影響了乳清蛋白-果膠膜的拉伸強度值。通過對回歸方程求極值點得：A=75.73，B=8.43，C=3.35，Y=1 248.24，即得出的最優工藝條件是反應時間75.73 h，乳化體系的pH值8.43，底物配比3.35∶1，在此條件下WPC-P膜拉伸強度值理論上能達到1 248.24 g。為了進一步驗證響應面優化設計結果的準確性，對上述結果進行近似驗證試驗，按照實際操作性將反應時間設定為76 h，反應體系的pH值設定為8.4，底物配比設定為3.0∶1，在此條件下進行3次WPC-P糖基化反應，乳清蛋白-果膠膜的平均TS值為1 247.13±0.29 g，與理論預測值基本相符，證明Box-Behnken模型適用于該試驗設計，在此條件下E值為31.52%，糖基化產物接枝度為49.523%。在響應面優化確定的條件下干法培養乳清蛋白，得到乳清蛋白膜的平均TS值為353.61±0.51 g。可以看出糖基化改性的乳清蛋白膜的TS值比對照乳清蛋白膜提高了2.5倍。

3 結論

本試驗在單因素試驗基礎上，通過正交試驗確定乳清蛋白-果膠干法糖基化的改性工藝，當果膠與乳清蛋白質量配比3∶1，反應時間76 h，反應體系的pH值8.4時，乳清蛋白-果膠產物膜的拉伸強度最高，比未改性的乳清蛋白膜提高了2.5倍。

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Optimization by Glycosylation Modifications of Whey Protein-pectin

CAI Dan，YUAN Xiuling，WANG Yuhua，XIU Lin，*LIU Jingsheng
（National Engineering Laboratory for Wheat and Corn Deep Processing，College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun，Jinlin 130118，China）

In order to improve the mechanical properties of whey protein concentrate（WPC） edible film，whey protein（WPC） -pectin（P） conjugate film was prepared by glycosylation modifications under dry-heating condition.The effects of Pectin/WPC ratio,reaction time and pH value on the tensile strength and elongation at break of WPC-SA conjugate film were analyzed.A single-factor and orthogonal test were employed to optimize the reaction conditions.The optimum reaction conditions were determined as Pectin/WPC radio of 3∶1，reaction time 76 h，pH value 8.4.Under these conditions,the experimental value of tensile strength （TS） of WPC-P conjugate film was 1 247.13±0.29 g and closely agreed with the theoretical value，the elongation at break（E） of WPC-P conjugate film was 31.52%，the graft degree of glycosylation products was 49.523%.

whey protein；pectin；glycosylation；tensile strength

TS201.2

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.12.037

1671-9646（2017） 12b-0035-04

2017-10-28

吉林省教育廳“十二五”科學技術研究項目（2015187）；國家“十二五”科技支撐計劃項目（2013BAD18B07）。

蔡 丹（1980— ），女，博士，副教授，研究方向為食品生物化學工程與功能性食品。

*通訊作者：劉景圣（1964— ），男，博士，教授，研究方向為糧食深加工與功能性食品。