鴿Ⅰ型副黏病毒F蛋白單克隆抗體的制備及鑒定

摘 要：為了制備鴿Ⅰ型副黏病毒融合蛋白（F蛋白）的單克隆抗體，以鴿Ⅰ型副黏病毒F基因抗原重組蛋白免疫BALB/C小鼠，得到能穩定分泌抗F蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞3株。對效價最高的一株進行特性測定，結果顯示其腹水抗體效價達到6.4×104以上，細胞培養上清液的效價達1︰800，其抗體亞類為lgG 2b，輕鏈為κ鏈，染色體數目為98條；血凝抑制試驗顯示單抗沒有血凝抑制效價；間接ELISA進行特異性試驗表明單抗與雞傳染性支氣管炎病毒、雞減蛋綜合征病毒、雞馬立克氏病病毒、豬瘟病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、羊痘病毒、大腸桿菌、沙門氏菌沒有交叉反應，而與雞新城疫病毒具有較強的交叉反應。PPMV-1 F蛋白單克隆抗體的制備為鴿Ⅰ型副黏病毒病新診斷方法的建立奠定了基礎。

關鍵詞：鴿Ⅰ型副黏病毒；F蛋白；單克隆抗體；制備

中圖分類號：S816.8 文獻標志碼：A 文章編號：1001-0769（2017）07-0036-04

鴿Ⅰ型副黏病毒（Pigeon Paramyxovirus-1，PPMV-1）普遍存在于肉鴿、信鴿和賽鴿等品種中，最為易感的是3 月齡以下的乳鴿，病死率可達50%～80%，嚴重的達到95%以上。該病是對養鴿業危害最嚴重的一種傳染病[1-3]。從20世紀80年代開始，國內外研究人員對鴿Ⅰ型副黏病毒開展了深入研究。PPMV-1與雞新城疫具有極高的血凝抑制交叉性反應，鴿免疫雞新城疫疫苗，用PPMV-1進行攻毒試驗，有些可達到完全免疫保護作用；PPMV-1與其同源血清的幾何平均血凝抑制（Hemagglutination Inhibition，HI）效價均高于用雞新城疫病毒測量的結果，但差異沒有統計學意義，因此，應用HI試驗區別這兩種病毒是無意義的[4]。但是，可以利用一些單抗來鑒別兩種病毒[5-7]。本研究把鴿Ⅰ型副黏病毒F基因重組蛋白免疫小鼠，取其脾臟和SP2/0細胞融合，按常規方法成功構建能分泌抗 PPMV-1 F蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，并制備單克隆抗體[8-9]，為PPMV-1檢測方法的建立奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、實驗動物及抗原毒株

SP2/0細胞由本實驗室保存。BALB/C小鼠購自蘭州獸醫研究所。純化的鴿Ⅰ型副黏病毒F基因重組蛋白由本課題制備保存。鴿新城疫病毒、雞新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、雞減蛋綜合征病毒、雞馬立克氏病病毒、豬瘟病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、羊痘病毒、大腸桿菌、沙門氏菌均由本課題組保存。

1.1.2 主要試劑

試劑主要有DMEM（GIBCO培養基）、RPMI-1640培養基、胎牛血清（HyClone）、PEG聚乙二醇1500溶液（Merck）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT選擇培養基、HT選擇培養基、牛血清蛋白（Bull Serum Albumin，BSA）、羊抗小鼠抗體和吐溫-20（Solarbio）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠免疫程序和方法

選6～8周齡18 g～20 g的雌性BALB/C小鼠，用PPMV-1 F基因重組蛋白作為免疫原，免疫4次，每次間隔2周。首免：200 μg抗原和等量的弗氏完全佐劑充分乳化后在小鼠背部皮下分點注射；二免：200 μg抗原和弗氏不完全佐劑充分乳化后在小鼠背部皮下分點注射；三免：200 μg抗原在小鼠腿部肌肉注射。7 d后尾靜脈采血測定血清效價，符合融合要求時加強免疫，于融合前3天用200 μg抗原腹腔注射。

1.2.2 雜交瘤細胞株的建立

將SP2/0細胞與免疫小鼠脾細胞按l︰10（1×107︰1×108）的比例于離心管中輕輕混勻，按照常規方法進行細胞融合后在二氧化碳培養箱中培養。融合后6 d～7 d逐漸用HT培養液代替HAT培養液。

1.2.3 雜交瘤陽性克隆的篩選

融合雜交瘤細胞生長到孔底部25%～35%時，用PPMV-1病毒為包被抗原的間接ELISA方法進行抗體篩檢。對陽性孔，用有限稀釋法對細胞進行克隆化培養。

1.2.4 單抗腹水的生產

將0.5 mL滅菌液體石蠟油注射于10周齡BALB/C小鼠腹腔進行預處理。1周后，將7.5×105雜交瘤細胞注射于預處理好的小鼠腹腔。等小鼠腹部膨大時用注射器采集腹水，離心后收集上清分裝，-80 ℃保存。

1.2.5 單抗效價的測定

將雜交瘤細胞培養上清液和腹水先分別稀釋100倍和4 000倍，再倍比稀釋，用間接酶聯免疫吸附測定（Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）方法進行抗體效價測定。同時，把400倍稀釋的小鼠抗鴿Ⅰ型副黏病毒陽性血清作為陽性對照，把400倍稀釋的正常小鼠和SP2/0細胞培養上清液作為陰性對照，把PBS作為空白對照，以P/N大于3的最低稀釋倍數即為其效價。

1.2.6 單克隆抗體特性的鑒定

對腹水效價最高的041E9株雜交瘤細胞株的特性進行鑒定。

抗體亞類的測定：采用鼠單克隆抗體分型試劑盒進行單抗亞型鑒定。

雜交瘤細胞染色體數目的統計分析：將041E9雜交瘤細胞株和SP2/0細胞按照文獻方法進行染色體計數[10]。

雜交瘤細胞株抗體分泌穩定性的測定：雜交瘤細胞株在凍存1個月后復蘇，傳代3次，然后用ELISA方法檢測其分泌抗體能力的穩定性。

1.2.7 單抗特異性試驗

分別用鴿新城疫病毒、雞新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、雞減蛋綜合征病毒、雞馬立克氏病病毒、豬瘟病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、羊痘病毒、大腸桿菌、沙門氏菌包被酶標板，用三株單抗腹水進行間接ELISA測定。

1.2.8 單抗的血凝抑制效價測定

采用微量血凝抑制方法進行單克隆抗體的血凝抑制試驗。首先把單抗腹水用生理鹽水倍比稀釋，然后加入4 IU病毒，37 ℃孵育一定時間后加入l%雞紅細胞懸液，37 ℃孵育，觀察結果。

2 結果

2.1 細胞融合與克隆

把免疫小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞融合，細胞融合率達到了70%以上，陽性率達到13%。最終獲得效價較高的陽性單克隆細胞株8株，用有限稀釋法對其中5株陽性雜交瘤細胞株進行3次克隆，獲得能夠穩定分泌抗PPMV-1 F蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞3株。

2.2 單抗腹水的制備及抗體效價

單抗腹水效價和細胞培養上清液效價測定結果見表1。

由上表可知，腹水抗體效價為6.4×104以上，細胞培養液效價為1︰800。

2.3 單克隆抗體特性的鑒定

2.3.1 單抗的亞型鑒定

041E9株單克隆抗體經鼠單克隆抗體分型試劑盒檢測后，其亞類為lgG 2b，輕鏈為κ鏈，見圖1。

2.3.2 雜交瘤細胞染色體數目統計結果

041E9株雜交瘤細胞平均染色體數為98條。

2.3.3 雜交瘤細胞株抗體分泌穩定性的測定

檢測結果表明，雜交瘤細胞在凍存和傳代后能保持穩定的抗體分泌能力。

單抗與其他病原的交叉反應結果表明：所制備的單抗與雞新城疫病毒具有較強的交叉反應。而與雞傳染性支氣管炎病毒、雞減蛋綜合征病毒、雞馬立克氏病病毒、豬瘟病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、羊痘病毒、大腸桿菌、沙門氏菌沒有交叉反應。因此，所制備的單抗具有較強的特異性。

2.4 單抗的血凝抑制效價

通過測定3株單抗的血凝抑制效價，結果表明3株單抗均沒有血凝抑制效價，符合預期實驗設計。

3 討論與分析

單抗是通過細胞雜交技術形成的具有分泌針對單一抗原決定簇的抗體的雜交瘤細胞株。通過克隆化得到來自單個細胞的雜交瘤細胞系，它們所分泌的抗體是針對同一抗原決定簇，具有高度同質性和特異性。自1975第一株單抗誕生以來，單抗的研究成為各行業研究的熱點。單克隆抗體為人和動物疾病的診斷、預防、治療以及免疫機制的研究開辟了廣闊前景。

免疫抗原的好壞對于獲得高質量的單抗極為重要。F蛋白位于PPMV-1囊膜外表面，形成纖突，對PPMV-1的毒力及感染性起決定性作用，是PPMV-1的主要免疫原性蛋白[11]。本實驗將PPMV-1 F蛋白作為免疫抗原制備單抗，將鴿Ⅰ型副黏病毒F基因片段和原核表達載體PGEX-4T-1相連接，構建重組質粒，經IPTG誘導表達得到了包涵體形式的重組蛋白，經過對包涵體蛋白提取后獲得純度較高的F蛋白。

決定細胞融合率和雜交瘤細胞陽性率高低的因素很多，其中最為關鍵的兩個因素是免疫抗原的純度和免疫的途徑。免疫途徑必須按照該免疫抗原的理化特性來選擇[12]。本實驗把PPMV-1 F蛋白作為免疫抗原，采用4次免疫的方法，首免和二免加弗氏佐劑在小鼠背部皮下分點注射，三免用純抗原在小鼠腿部肌肉注射，并于融合前3天用純抗原腹腔注射進行加強免疫。該方法取得了較好的免疫效果，融合率達到70%，陽性率達13%。

骨髓瘤細胞的活性也會影響細胞的融合率。如果發現較多骨髓瘤細胞逆轉，可用20 μg/mL 8-AG處理細胞，確保所有參與融合的骨髓瘤細胞均為次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核苷轉移酶缺失（HGPRT-）細胞。

在細胞融合的過程中，骨髓瘤細胞和脾細胞需要達到合適的比例，比值可從1︰2至1︰10不等，1︰3或1︰5最為常用。本實驗采用1︰5的比例進行融合，取得了較好的效果。在加入融合劑前，應使骨髓瘤細胞和脾細胞充分混勻，然后再加入融合劑。否則，骨髓瘤細胞因為大而位于離心管下層，脾細胞因為小而位于離心管上層，對融合率有很大影響[13-15]。

本試驗以鴿Ⅰ型副黏病毒F基因片段原核表達的蛋白作為抗原，用間接ELISA方法進行單抗的篩選，獲得3株穩定分泌抗PPMV-1 F蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株。對其中效價最高的一株進行特性測定，其腹水抗體效價為6.4×104以上，細胞培養液的效價為1︰800，其亞類為lgG 2b，輕鏈為κ鏈，染色體數目為98條。血凝抑制試驗顯示單抗沒有血凝抑制效價。間接ELISA特異性試驗表明單抗與雞傳染性支氣管炎病毒、雞減蛋綜合征病毒、雞馬立克氏病病毒、豬瘟病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、羊痘病毒、大腸桿菌、沙門氏菌沒有交叉反應，而與雞新城疫病毒具有較強的交叉反應。

參考文獻：（15篇，略）