2株H9亞型禽流感病毒的分離鑒定

[摘 要] 本文從山東省某雞場采集的疑似禽流感的病料樣品中分離出2株病毒，通過RT-PCR及測序分析，鑒定該毒株為H9亞型禽流感病毒（AIV）。序列比對結果顯示，常見疫苗株SS 94株、F98株等屬于A/DK/HK/Y280/97-1ike分支中的1.2亞分支，而分離出的2株H9毒株均屬于歐亞譜系A/DK/HK/Y280/97-1ike分支1.1亞分支，與常見疫苗株不在同一亞分支上，提示分離毒株與常規疫苗株相比，已發生較明顯的遺傳變異。

[關鍵詞] 禽流感病毒；H9亞型；分離；鑒定

[中圖分類號] S852.65 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-7909（2017）32-72-2

禽流感屬于正黏病毒科流感病毒屬，是由A型流感病毒（Avian Influenzavirus，AIV）引起的一種禽類感染或疾病綜合征，被國際獸疫局定為A類傳染病。根據A型流感病毒表面抗原——血凝素（HA）和神經氨酸酶（NA）抗原性的不同，目前將禽流感病毒（AIV）分為16種HA亞型（H1～H16）和10種NA亞型（N1～N10）。

根據禽流感對禽類致病性強弱的差異，AIV可分為高致病性禽流感和低致病性禽流感2種。目前，我國雞群中存在的主要是低致病性禽流感[1-2]，感染該病毒后通常沒有特征性癥狀，死亡率不高，但能夠使產蛋雞產蛋率下降，降低雛雞的免疫抵抗力，易受到其他病毒病及支原體感染而發生嚴重的呼吸道疾病，影響生產性能。近年來，國家相關實驗室臨床監測顯示，國內商品肉雞發病死亡雞群中H9N2亞型禽流感感染率為72%～85%，雞只感染H9亞型禽流感后通常會引起新城疫、傳染性支氣管炎等其他病毒病，而且繼發大腸桿菌、沙門氏菌細菌、支原體等疾病。

本試驗研究對2017年在山東地區分離得到的2株禽流感毒株進行分離鑒定，進一步對陽性結果進行測序，旨在進一步了解山東地區的H9亞型禽流感的流行情況，為H9亞型禽流感進一步的防控和疫苗研制提供科學依據。

1 試驗材料

1.1 病料樣品、雞胚

2017年6月，從山東地區采集雞場病死雞的肺、腎、脾、肝等臟器病料樣品。9～11日齡SPF雞胚和種蛋，購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司。

1.2 試驗試劑

RNA提取試劑盒購自Takara公司，反轉錄試劑盒購自TIANGEN公司，2×Taq PCR Master Mix購自Promega公司。

1.3 試驗儀器

培養箱、微量振蕩器、孵化機、生物安全柜、超凈工作臺、分析天平、離心機、PCR擴增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀、液氮罐或-70 ℃冰箱、微波爐、高通量研磨器、-20 ℃冰箱和水浴鍋等。

1.4 引物設計及合成

根據GenBank上發表的禽流感H9N2的HA和NP基因序列，分別設計2對禽流感引物：引物NP-F和NP-R擴出的片段約750 bp，H9特異性引物HA-F和HA-R擴出的片段約488 bp。

2 試驗方法

2.1 病毒分離

采集病死雞支氣管干酪樣物質、肺臟、肝臟、脾臟等組織，將病料剪碎研磨，按1∶5加入生理鹽水。凍融3次，3 000 r/min離心15 min，取上清液經0.22 μm濾膜過濾，將過濾液經尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，0.12 mL/枚，于37 ℃培養繼續孵育96 h，收獲24～96 h死胚尿囊液、96 h死胚及活胚尿囊液，然后盲傳2代。

2.2 病毒PCR鑒定

2.2.1 病毒核酸的提取。按照病毒RNA提取試劑盒操作說明對2株H9分離株進行RNA提取和反轉錄。

2.2.2 PCR反應。PCR反應體系25 μL：2×Easy-Taq PCR SuperMix 12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。

2.2.3 PCR產物克隆及序列分析。將PCR產物連接到pMD18-T載體并克隆到Trans5α感受態細胞，送至北京華大基因研究中心有限公司進行測序，測序結果采用DNAstar軟件分析，與GenBank中H9亞型禽流感的HA基因進行同源性比較。

3 結果與分析

利用禽流感病毒反轉錄通用引物NP基因引物對2株NP基因進行擴增，得到與預期大小約750 bp相符的片段（見圖1）；利用H9特異性HA引物進行RT-PCR檢測，結果顯示擴增出約488 bp的目的片段（見圖2）。

利用軟件對將分離株A/CK/CH/ShanDong/0623/2017/1和A/CK/CH/ShanDong/0623/2017/2HA基因測序結果與GenBank中18株H9N2亞型禽流感參考毒株進行系統進化分析，結果見圖3。

4 討論

目前，H9N2亞型禽流感病毒在世界廣泛流行，該病毒感染發病后通常沒有特征性癥狀，死亡率不高，但能夠引起呼吸道疾病，影響產蛋雞產蛋率和肉雞生長增質量，對養禽業造成嚴重的經濟損失。禽流感病毒是單股負鏈RNA病毒，禽流感的核苷酸的堿基位點具有很高的突變性，這也使得H9亞型禽流感的抗原性變化頻繁，對防控H9亞型禽流感帶來難度[3]。所以，加強H9亞型禽流感病毒的基因序列等生物學特性的研究，對于家禽養殖業來說具有非常重要的意義。

本研究分離的2株H9雞源禽流感病毒，序列比對結果顯示，常見疫苗株SS 94株、F98株等屬于A/DK/HK/Y280/97-1ike分支中的1.2亞分支，而分離出的2株禽流感分離株為H9N2亞型禽流感。HA基因進化分析表明，兩毒株均屬于歐亞譜系A/DK/HK/Y280/97-1ike分支1.1亞分支，與常見疫苗株而常見疫苗株SS 94株、F98株等屬于A/DK/HK/Y280/97-1ike分支中的1.2亞分支不在同一亞分支上，表明該毒株分離毒株與常規疫苗株相比，已發生較明顯的遺傳變異。

參考文獻

[1]付朝陽.H9亞型禽流感油乳劑滅活疫苗體液及細胞免疫應答的監測研究[D].北京：中國農業科學院，2001.

[2]萬曉朋.中國大陸H9N2亞型禽流感病毒遺傳演化分析及疫苗株的選擇[D].北京：中國農業科學院，2010.

[3]Liu D，Shi W，Shi Y，et al. Origin and diversity of novel avian influenza A H7N9 viruses causing human infection：phylo-genetic，structural，and coalescent analyses[J].Lancet，2013（9881）：1926-1932.