抑制miR-29對(duì)胰腺癌PANC1細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響

陳棟 趙萍 陸連芳 蘇彤 任清霞 賈巍 王全 王春陽(yáng)

抑制miR-29對(duì)胰腺癌PANC1細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響

陳棟 趙萍 陸連芳 蘇彤 任清霞 賈巍 王全 王春陽(yáng)

目的觀察抑制miR-29對(duì)胰腺癌PANC1細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響，探討其可能機(jī)制。方法以抑制miR-29表達(dá)的寡核苷酸(anti-miR-29)及對(duì)照寡核苷酸(miR-NC)轉(zhuǎn)染PANC1細(xì)胞，構(gòu)建anti-miR-29-PANC1細(xì)胞及miR-NC-PANC1細(xì)胞，并采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PUMA-siRNA、E-cadherin-siRNA或NC-siRNA方法構(gòu)建共轉(zhuǎn)染的anti-miR-29+PUMA-siRNA-PANC1細(xì)胞及anti-miR-29+E-cadherin-siRNA-PANC1細(xì)胞。觀察各組細(xì)胞的克隆形成數(shù)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，劃痕試驗(yàn)檢測(cè)癌細(xì)胞遷移能力。采用anti-miR-29-PANC1 細(xì)胞皮下注射建立裸鼠移植瘤模型，靜脈注射建立肺轉(zhuǎn)移模型，以注射PANC1細(xì)胞作為對(duì)照。觀察移植瘤的生長(zhǎng)情況及肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量， TUNEL法檢測(cè)移植瘤的細(xì)胞凋亡，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)移植瘤的PUMA、E-cadherin表達(dá)。結(jié)果PANC1、miR-NC-PANC1、anti-miR-29-PANC1組的細(xì)胞存活率分別為100%、(96.8±2.8)%、(24.4±3.2)%；細(xì)胞克隆形成數(shù)為(213±36)、(196±28)、(37±6)個(gè)/100倍視野；穿膜細(xì)胞數(shù)為(56.3±9.6)、(49.8±7.3)、(11.2±3.4)個(gè)/400倍視野；細(xì)胞的遷移距離為(260±48)、(247±46)、(53±7)μm；細(xì)胞凋亡率分別為(1.5+0.9)%、(2.6+0.9)%、(22.4+2.8)%，anti-miR-29-PANC1組細(xì)胞與其他2組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。anti-miR-29+PUMA-siRNA-PANC1組的細(xì)胞存活率為(84.7±10.9)%，細(xì)胞凋亡率為(1.3±0.8)%；anti-miR-29+E-cadherin-siRNA-PANC1的穿膜細(xì)胞數(shù)為(49.7±6.4)個(gè)/400倍視野，細(xì)胞遷移距離為(182±36)μm，均消除抑制miR-29表達(dá)對(duì)PANC1細(xì)胞所帶來(lái)的影響(P值均<0.05)。PANC1、anti-miR-29-PANC1細(xì)胞移植瘤的體積分別為(3 800±270)、(1 890±160)mm3，細(xì)胞凋亡指數(shù)為0.93±0.14、8.26±1.15，肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)為(26.4±6.5)、(8.6±2.7)個(gè)，PUMA陽(yáng)性表達(dá)率為(7.2±1.6)%、(43.8±7.6)%，E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率為(8.3±3.6)%、(47.4±5.7)%。anti-miR-29-PANC1組移植瘤體積、肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)較對(duì)照組顯著減小或減少，而細(xì)胞凋亡、PUMA及E-cadherin表達(dá)顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。結(jié)論抑制miR-29表達(dá)后PANC1細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力下降，其機(jī)制可能與上調(diào)PUMA及E-adherin表達(dá)有關(guān)。

胰腺腫瘤； 腫瘤轉(zhuǎn)移； 細(xì)胞凋亡； 基因，抑制； miR-29

microRNAs(miRNA)是一種廣泛存在于真核生物細(xì)胞中非編碼的長(zhǎng)19～24 nt的單鏈小分子RNA，是最大的一類(lèi)基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子[1]。目前研究表明，多種miRNA參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移，并可作為腫瘤治療的有效靶點(diǎn)。miRNA-29(miR-29)家族是一類(lèi)抑癌基因，在多種惡性腫瘤細(xì)胞內(nèi)低表達(dá)，對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移起負(fù)調(diào)控作用[2-5]，但研究表明胰腺癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-29,且增加miR-29表達(dá)能明顯增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力[6]。研究發(fā)現(xiàn)，促凋亡蛋白PUMA和Ca2+依賴(lài)性細(xì)胞黏附分子超家庭成員E-鈣黏蛋白(E-cadherin)均在抑制腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起著重要作用[7-9]。本研究通過(guò)抑制胰腺癌PANC1細(xì)胞miR-29表達(dá)，觀察其與PUMA、E-cadherin之間的關(guān)系，探討它對(duì)胰腺細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響及可能的作用機(jī)制。

材料與方法

一、miRNA或siRNA轉(zhuǎn)染PANC1細(xì)胞

人胰腺癌PANC1細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞所,常規(guī)培養(yǎng)、傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時(shí)棄完全培養(yǎng)基，用無(wú)血清DMEM清洗2次，每孔加入2 ml無(wú)血清無(wú)抗生素的DMEM培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h，采用Lipofectamine2000將100 nmol/L抗miR-29的寡核苷酸(anti-miR-29)轉(zhuǎn)染PANC1細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后更換為含10% FBS的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。應(yīng)用400 μg/ml G418篩選2～3周以獲得穩(wěn)定低表達(dá)miR-29的anti-miR-29-PANC1細(xì)胞株。以轉(zhuǎn)染100 nmol/L無(wú)匹配miRNA的miR-NC-PANC1細(xì)胞作為對(duì)照。anti-miR-29和miR-NC均購(gòu)自北京傲銳東源生物科技有限公司。此外，對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染anti-miR-29-PANC1細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PUMA-siRNA或E-cadherin-siRNA 48 h，構(gòu)建共轉(zhuǎn)染的anti-miR-29+PUMA-siRNA-PANC1細(xì)胞及anti-miR-29+E-cadherin-siRNA-PANC1細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染無(wú)匹配的NC-siRNA的PANC1細(xì)胞作為對(duì)照組。PUMA-siRNA、E-cadherin-siRNA及NC-siRNA均購(gòu)自Cell Signaling Technology(上海)公司。

二、各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞目的基因及蛋白表達(dá)檢測(cè)

收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PANC1細(xì)胞，用預(yù)冷PBS清洗后加入Trizol提取細(xì)胞總RNA，按試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)說(shuō)明書(shū)操作。采用熒光定量PCR法檢測(cè)miR-29, PUMA、E-cadherin mRNA的表達(dá)。引物序列(5′-3′)：miR-29上游為ACTTGAACATGATTCCGTGTGA，下游為CTTTAGTGTTGGAGATGTTAGG；E-cadherin上游為CAGAAGGGAAAGACTTCGTAT；下游為AACGGCTGAGGGAACTC；PUMA上游為CAGAAGGGAAAGACTTCGTAT；下游為 AACGGCTGAGGGAACTC；內(nèi)參U6上游為CTCACAGCCGCATCTACTT；下游為GACAAGACATGATTCCGG。引物由銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成。先逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再行PCR擴(kuò)增。PCR條件：95℃ 3 min，95℃ 3 s、58℃ 33 s、72℃ 10 s，共38個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后行擴(kuò)增曲線和融解曲線分析。由PCR儀自帶軟件獲取Ct值，通過(guò)公式2-△△Ct計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PANC1細(xì)胞，用預(yù)冷PBS清洗后加入裂解液提取細(xì)胞總蛋白，Lowry法定量蛋白后常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞PUMA、E-cadherin蛋白表達(dá)。兔抗人PUMA、E-cadherin一抗1∶200稀釋?zhuān)蚩雇枚? ∶2 500稀釋?zhuān)筆UMA、E-cadherin抗體均購(gòu)自Santa(上海)公司。最后ECL發(fā)光，X片曝光、顯影、定影。以GAPDH為內(nèi)參照。用圖像掃描軟件掃描條帶的灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示目的蛋白表達(dá)量。

三、細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

采用噻唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定細(xì)胞增殖能力。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PANC1、miR-NC-PANC1、anti-miR-29-PANC1、anti-miR-29+PUMA-siRNA-PANC1細(xì)胞接種于96孔板，每孔2×103個(gè)細(xì)胞(0.2 ml)，每組設(shè)5個(gè)平行孔，常規(guī)培養(yǎng)4 h，換完全培養(yǎng)基后再培養(yǎng)72 h，每孔加入MTT(5 mg/ml)20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，加入100 μl的DMSO振蕩10 min，上酶聯(lián)檢測(cè)儀測(cè)各孔波長(zhǎng)490 nm處的值(A490值)。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞存活率。存活率=100%-(對(duì)照組A490值-實(shí)驗(yàn)組A490值)/對(duì)照組A490值×100%。

四、克隆形成實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PANC1、miR-NC-PANC1、anti-miR-29-PANC1細(xì)胞，用0.25%胰酶消化并制成單細(xì)胞懸液，每組取600個(gè)細(xì)胞接種于底層鋪0.5%瓊脂糖，頂層鋪0.3%瓊脂糖的60 mm軟瓊脂培養(yǎng)皿，常規(guī)培養(yǎng)14 d。倒置顯微鏡下(100倍)隨機(jī)選擇10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)50個(gè)直徑>0.05 mm的克隆數(shù)和總克隆數(shù)，克隆形成率=>0.05 mm的克隆數(shù)/總克隆數(shù)×100%。然后在每孔加入1 ml的0.005%結(jié)晶紫染色1 h以上，鏡下攝片。

五、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PANC1、miR-NC-PANC1、anti-miR-29-PANC1、anti-miR-29+PUMA-siRNA-PANC1細(xì)胞用0.25%EDTA-胰酶消化，取3.0×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板各孔中，常規(guī)培養(yǎng)72 h，收集細(xì)胞，PBS洗滌2次后重懸于100 μl含Annexin V-FITC和0.5 μg PI的結(jié)合緩沖液，混勻，室溫下避光培養(yǎng)10 min，用結(jié)合緩沖液洗滌懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×106個(gè)/ml，避光室溫孵育20 min，加入400 μl結(jié)合緩沖液，30 min內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

六、體外侵襲實(shí)驗(yàn)

于Transwell小室的聚碳酸酯膜表面加入50 μ1 Matrigel，待其凝固。收集PANC1細(xì)胞消化后行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×108/L。在Transwell上室加入含2×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液200 μl，下室每孔加入500 μl含血清的1640培養(yǎng)基，37℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)24 h，甲醇固定30 min，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色。每組設(shè)3個(gè)小室，每張膜計(jì)數(shù)5個(gè)400倍視野下的穿膜細(xì)胞數(shù)，取均值。

七、體外細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

將各組PANC1細(xì)胞接種于6孔板，以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)至細(xì)胞將近長(zhǎng)滿，換無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)24 h后，以1 ml移液器吸頭在細(xì)胞層仔細(xì)劃痕，用PBS洗2遍，去除細(xì)胞碎片，更換含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡下對(duì)劃痕前后的相應(yīng)區(qū)域拍照。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。以上邊緣、中間和下邊緣3個(gè)直線距離評(píng)估劃痕長(zhǎng)度，使用ImageJ軟件(NIH，Bethesda，MD，USA)進(jìn)行長(zhǎng)度定量。

八、裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

裸鼠20只，4～6周齡，體重17～22 g，購(gòu)于中科院上海動(dòng)物研究所。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PANC1、anti-miR-29-PANC1細(xì)胞，消化制成單細(xì)胞懸液，密度均為1×108/ml,臺(tái)盼蘭染色測(cè)細(xì)胞活力大于90%。經(jīng)裸鼠尾靜脈注射200 μl細(xì)胞懸液，每組6只。常規(guī)飼養(yǎng)3周后處死裸鼠，肉眼觀察肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量，取轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)常規(guī)病理檢查，并采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的E-cadherin蛋白表達(dá)。

同時(shí)，取兩種細(xì)胞懸液接種于裸鼠背部皮下，每組4只，飼養(yǎng)6周，每周測(cè)量腫塊體積2次，腫瘤體積(V)=長(zhǎng)×寬×高×π/6(mm3)。4周后處死裸鼠。

九、移植瘤PUMA、E-cadherin蛋白表達(dá)檢測(cè)

采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)移植瘤組織標(biāo)本PUMA、E-cadherin蛋白表達(dá)，以武漢博士德公司提供的已知人直腸癌切片作陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。抗PUMA抗體稀釋度為1∶50，抗E-cadherin抗體稀釋度為1∶100。顯微鏡下觀察5個(gè)視野， PUMA蛋白以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色細(xì)顆粒為陽(yáng)性，E-cadherin蛋白以細(xì)胞膜內(nèi)有棕黃色細(xì)顆粒為陽(yáng)性。陽(yáng)性細(xì)胞≤10%為陰性，>10%為陽(yáng)性。

十、移植瘤的細(xì)胞凋亡檢測(cè)

取各組移植瘤標(biāo)本，采用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)以上高倍視野，每個(gè)視野不少于1 000個(gè)細(xì)胞，綠色為凋亡細(xì)胞。凋亡指數(shù)(AI)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)。

十一、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、轉(zhuǎn)染細(xì)胞的鑒定

PANC1、miR-NC-PANC1、anti-miR-29-PANC1組細(xì)胞的miR-29表達(dá)量分別為0.317±0.030、0.287±0.020、0.034±0.004。anti-miR-29-PANC1組miR-29表達(dá)水平降低90%以上，miR-NC-PANC1組無(wú)明顯下降，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.362，P<0.01)。

PANC1、NC-siRNA-PANC1、anti-miR-29-PANC1、anti-miR-29+E-cadherin-siRNA-PANC1組細(xì)胞的E-cadherin mRNA表達(dá)量分別為0.94±0.16、1.05±0.17、7.38±1.68、0.98±0.14。anti-miR-29-PANC1組顯著高于其他3組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為4.564、4.342、4.282，P值均<0.01)。E-cadherin蛋白表達(dá)的變化與mRNA表達(dá)一致(圖1)。

PANC1、NC-siRNA-PANC1、anti-miR-29-PANC1、anti-miR-29+PUMA-siRNA-PANC1組細(xì)胞的PUMA mRNA表達(dá)量分別為1.17±0.18、1.23±0.21、6.45±1.36、1.04±0.16。anti-miR-29-PANC1組顯著高于其他3組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為3.863、3.980、4.106,P值均<0.01)。PUMA蛋白表達(dá)的變化與mRNA表達(dá)一致(圖2)。

圖1 PANC1(1)、NC-siRNA-PANC1(2)、anti-miR-29-PANC1(3)、anti-miR-29+E-cadherin-siRNA-PANC1組(4)細(xì)胞的E-cadherin 蛋白表達(dá) 圖2 PANC1(1)、NC-siRNA-PANC1(2)、anti-miR-29-PANC1(3)、anti-miR-29+PUMA-siRNA-PANC1組(4)細(xì)胞的PUMA蛋白表達(dá)

二、各組PANC1 細(xì)胞的生長(zhǎng)、克隆形成和細(xì)胞凋亡

PANC1、miR-NC-PANC1、anti-miR-29-PANC1、anti-miR-29+PUMA-siRNA-PANC1組的細(xì)胞存活率分別為100%、(96.8±2.8)%、(24.4±3.2)%、(84.7±10.9)%，anti-miR-29-PANC1組的細(xì)胞存活率顯著低于其他3組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。

PANC1、miR-NC-PANC1和anti-miR-29-PANC1組的細(xì)胞克隆形成數(shù)分別為(213±36)、(196±28)、(37±6)個(gè)/100倍視野，anti-miR-29-PANC1組顯著少于其他2 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，圖3)。

圖3 PANC1(3A)、miR-NC-PANC1(3B)、anti-miR-29-PANC1(3C)細(xì)胞形成的克隆

PANC1、miR-NC-PANC1、anti-miR-29-PANC1、anti-miR-29+PUMA-siRNA-PANC1組細(xì)胞凋亡率分別為(1.5±0.9)%、(2.6±0.9)%、(22.4±2.8)%、(1.3±0.8)%。抑制PANC1細(xì)胞miR-29表達(dá)顯著增加細(xì)胞凋亡率，而雙抑制miR-29及PUMA表達(dá)的PANC1細(xì)胞凋亡率又回復(fù)到親本細(xì)胞水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，圖4)。

圖4 PANC1(4A)、miR-NC-PANC1(4B)、anti-miR-29-PANC1(4C)、anti-miR-29+PUMA-siRNA-PANC1(4D)組的細(xì)胞凋亡

三、anti-miR-29對(duì)PANC1細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響

PANC1、miR-NC-PANC1、anti-miR-29-PANC1、anti-miR-29+E-cadherin-siRNA-PANC1組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(56.3±9.6)、(49.8±7.3)、(11.2±3.4)、(49.7±6.4)個(gè)/400倍視野；細(xì)胞的遷移距離分別為(260±48)、(247±46)、(53±7)、(182±36)μm。抑制miR-29表達(dá)的PANC1組侵襲及遷移能力顯著低于親本細(xì)胞，而雙抑制miR-29及E-cadherin表達(dá)的PANC1細(xì)胞的侵襲及遷移能力又回復(fù)到親本細(xì)胞水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01，圖5、6)。

圖5 PANC1(5A)、miR-NC-PANC1(5B)、anti-miR-29-PANC1(5C)組的穿膜細(xì)胞數(shù)(HE ×400)

圖6 PANC1(6A)、miR-NC-PANC1(6B)、anti-miR-29-PANC1(6C)組細(xì)胞24 h的遷移距離

四、各組PANC1細(xì)胞的皮下移植瘤生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移

PANC1、anti-miR-29-PANC1細(xì)胞皮下移植后4周，移植瘤的體積分別為(3 800±270)、(1 890±160)mm3，anti-miR-29-PANC1組腫瘤生長(zhǎng)抑制率達(dá)50%以上(圖7)；移植瘤的細(xì)胞AI分別為0.93±0.14、8.26±1.15，PUMA陽(yáng)性表達(dá)率為(7.2±1.6)%、(43.8±7.6)%，anti-miR-29-PANC1組細(xì)胞凋亡及PUMA表達(dá)均顯著增加(圖8)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均< 0.05)。

圖7 PANC1、anti-miR-29-PANC1細(xì)胞皮下種植后的生長(zhǎng)曲線

圖8 PANC1(8A)、anti-miR-29-PANC1(8B)細(xì)胞皮下移植瘤的細(xì)胞凋亡(TUNEL染色)

PANC1、anti-miR-29-PANC1細(xì)胞注射后3周，肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)分別為(26.4±6.5)、(8.6±2.7)個(gè)，anti-miR-29-PANC1組顯著少于親本細(xì)胞(圖9)；E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率分別為(8.3±3.6)%、(47.4±5.7)%, anti-miR-29-PANC1組顯著高于親本細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均< 0.05)。

圖9 PANC1、anti-miR-29-PANC1細(xì)胞皮下移植瘤的PUMA(9A、9B ×100)、E-cadherin(9C、9D ×100)及肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的病理圖(9E、9F ×200)

討 論

胰腺癌是一種高度惡性的腫瘤，由于發(fā)病部位的特殊性以及癥狀的隱匿性，絕大多數(shù)患者在確診時(shí)已屬晚期，多數(shù)不能手術(shù)切除[7]。盡管結(jié)合放療、化療等方法進(jìn)行綜合治療，但結(jié)果都不令人滿意，因此提高胰腺癌的療效需要探索新的治療方法[8]，其中基因治療被寄予厚望。

前期的研究發(fā)現(xiàn)，miR-29在胰腺癌組織中的表達(dá)明顯增加，且miR-29表達(dá)增加與胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移和2年生存率明顯相關(guān)[9]，推測(cè)miR-29可作為胰腺癌基因治療的靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，靶向抑制miR-29表達(dá)后，胰腺癌PANC1細(xì)胞的增殖被抑制，細(xì)胞凋亡明顯增加，細(xì)胞的侵襲和運(yùn)動(dòng)能力明顯下降；miR-29表達(dá)抑制的PANC1細(xì)胞的皮下移植瘤生長(zhǎng)緩慢，肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量少，提示抑制miR-29表達(dá)能明顯抑制移植瘤生長(zhǎng)和肺臟轉(zhuǎn)移，與Qiu等[10]和Inoue等[11]在喉癌和直腸癌的研究結(jié)果相一致，但miR-29發(fā)揮作用的信號(hào)途徑尚不清楚。

PUMA是2001年發(fā)現(xiàn)的具有較強(qiáng)促凋亡作用的p53下游基因，在許多惡性腫瘤中表達(dá)缺失或低表達(dá)，PUMA低表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。上調(diào)細(xì)胞內(nèi)PUMA表達(dá)可顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)[12-13]。本研究結(jié)果顯示，抑制miR-29表達(dá)后，PANC1細(xì)胞的PUMA表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，細(xì)胞凋亡增加；同時(shí)采用RNA干擾技術(shù)抑制PUMA表達(dá)后，細(xì)胞生長(zhǎng)加快，細(xì)胞凋亡明顯下降，表明miR-29通過(guò)抑制PUMA表達(dá)來(lái)增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制細(xì)胞凋亡。

E-cadherin是Ca2+依賴(lài)性細(xì)胞黏附分子超家族成員之一，介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞間的黏附，在抑制腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起著重要作用[14]。本研究結(jié)果顯示，抑制miR-29表達(dá)后，PANC1細(xì)胞誘導(dǎo)E-cadherin表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞侵襲能力被抑制；而干擾E-cadherin表達(dá)后，細(xì)胞的侵襲能力顯著增強(qiáng)，表明miR-29通過(guò)抑制E-cadherin的表達(dá)從而增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

由此可見(jiàn)， miR-29通過(guò)上調(diào)PUMA和E-cadherin的表達(dá)，增強(qiáng)PANC1細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移能力， miR-29可能是潛在的治療胰腺癌的靶點(diǎn)。

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InhibitingmiR-29ongrowth,invasionandmetastasisofPANC1cells

ChenDong,ZhaoPing,LuLianfang,SuTong,RenQingxia,JiaWei,WangQuan,WangChunyang.

DepartmentofGeneralSurgeny,AffiliatedHospitalofQingdaoUniversity,Qingdao266003,China

ObjectiveTo investigate the effects of inhibiting miR-29 on growth, invasion and metastasis of pancreatic cancer PANC1 cells, and explore the potential mechanism.MethodsOligonucleotides inhibiting miR-29 (anti miR-29) and control oligonucleotides (miR NC) were used to transfect PANC1 cells to establish anti miR-29 PANC1 cells and miR NC PANC1 cells. Transient transfection of PUMA siRNA, E-cadherin siRNA or NC siRNA was used to construct cotransfected anti miR29+ PUMA-siRNA-PANC1 cells and anti-miR-29+E-cadherin-siRNA-PANC1 cells. Number of colony formations was observed, cell survival was detected by MTT, cell apoptosis was measured by flow cytometry, cell invasion was detected by transwell chamber assay, and cell migration was detected by wound healing assay. Subcutaneous injection of anti miR-29 PANC1 cells was used to establish xenograft nude mice model, and venous injection of anti miR-29 PANC1 cells was used to establish lung metastasis nude mice model, and the subcutaneous and venous injection of PANC1 cells served as control. The growth of xenograft and the number of lung metastatic nodules were observed. TUNEL method was used to detect cell apoptosis in xenograft and immunohistochemical analysis was used to detect PUMA and E-cadherin in xenograft.ResultsThe survival rate of PANC1,miR-NC-PANC1 and anti-miR-29-PANC1 cells was 100%,(96.8±2.8)% and(24.4±3.2)%. The number of colony formation was (213±36),(196±28) and(37±6)per 100 high power field. The number of transmembrane cells was (56.3±9.6),(49.8±7.3) and (11.2±3.4) per 400 high power field. The distance of cell migration was(260±48),(247±46) and(53±7)μm. Cell apoptosis rate was(1.5+0.9)%，(2.6+0.9)% and(22.4+2.8)%. There was statistically significant difference between anti miR 29 PANC1 cells and other PANC1 cells (P<0.05). The survival rate, apoptosis rate, transmembrane cells and migration distance of anti-miR-29+PUMA-siRNA-PANC1 cells was (84.7±10.9)%，(1.3±0.8)%,(49.7±6.4)per 400 high power field and(182±36)μm, indicating that the effects of miR 29 inhibition on PANC1 cells were abolished (allP<0.05). The volume of the xenograft of PANC1 and anti-miR-29-PANC1 cells was (3 800±270) and (1 890±160)mm3, the cell apoptosis rate was 0.93±0.14 and 8.26±1.15, the number of metastatic lung lesions was (26.4±6.5) and(8.6±2.7)，the PUMA positivity was(7.2±1.6)% and(43.8±7.6)%，E-cadherin positivity was(8.3±3.6)% and(47.4±5.7)%, respectively. The xenograft volume and the number of metastatic lung nodules of anti miR29 PANC1 cells was obviously decreased or decreased, but cell apoptosis rate, PUMA positivity and E cadherin positivity were obviously increased, and the differences were all statistically significant (P<0.05).ConclusionsInhibiting miR-29 expression can decrease cell proliferation, migration and metastasis of PANC1 cells, and the potential mechanism may be associated with the upregulation of PUMA and E-cadherin.

Pancreatic neoplasms; Neoplasm metastasis; Apoptosis; Genes, suppressor; miR-29

FundprogramHospital-level Issues from Jiangsu Provincial Cancer Hospital(ZN201611)；Social Development Project from Jiangsu Province(BE2015668)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.06.007

266003 山東青島，青島大學(xué)附屬醫(yī)院普通外科(陳棟、趙萍、蘇彤)，肝膽胰外科(陸連芳)；日照市人民醫(yī)院肝膽外科(任清霞)；天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院肝膽胰外科(任清霞、賈巍)；山東省省立醫(yī)院肝膽胰外科(王全、王春陽(yáng))

王春陽(yáng)，Email:blooddoc@126.com

江蘇省腫瘤醫(yī)院院級(jí)課題(ZN201611)；江蘇省社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(BE2015668)

2017-03-05)

屠振興)