自噬在大鼠急性胰腺炎中的變化

蘇濤 劉丕 柯華婧 楊曉娟 李驥

·短篇論著·

自噬在大鼠急性胰腺炎中的變化

蘇濤 劉丕 柯華婧 楊曉娟 李驥

急性胰腺炎(AP)是各種原因引起胰酶激活、以炎癥局部反應為主要特征、伴或不伴有其他器官改變的疾病[1]。目前AP的發(fā)病機制仍不是很清楚，臨床治療上難度較大。研究顯示[2]，AP時腺泡細胞中有空泡的積累，且大多數(shù)空泡為自噬空泡，自噬可能與炎癥反應及細胞的死亡關(guān)系密切[3-4]。本研究旨在探討自噬在牛膽酸鈉誘導的大鼠AP發(fā)病過程中的變化情況。

一、材料和方法

1．材料：健康清潔雌性SD大鼠54只，體重200～250 g，由南昌大學醫(yī)學院動物部提供。其他材料包括LC3B兔多克隆抗體(Abcam公司)，p62鼠單克隆抗體(Abcam公司)，牛磺膽酸鈉(Sigma公司)，二步法兔二抗和鼠二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

2．動物分組：將54只大鼠按照隨機分配原則分為假手術(shù)組(SO)、急性水腫性胰腺炎(AEP)組、急性壞死性胰腺炎(ANP)組，每組18只。每組再隨機分成3、6、12 h 3個時間點，每時間點6只。

3．大鼠胰腺炎模型的建立和標本的獲取：AEP組采用胰膽管逆行注射1%牛磺膽酸鈉(0.1 ml/100 g體重)、ANP組注射5%牛磺膽酸鈉(0.1 ml/100 g體重)的方法建模，假手術(shù)組與模型組相同手術(shù)方式，但不注射藥物。每組大鼠分別于術(shù)后第3、6、12 h取標本。

4．觀察的指標與檢測：(1)血清淀粉酶：由南昌大學第一附屬醫(yī)院檢驗科采用全自動生化儀檢測。(2)胰腺組織病理學：由病理醫(yī)師閱片，選取5個高倍視野，采用改良Schmidt評分標準對胰腺的損傷進行評分。(3)超微結(jié)構(gòu)觀察：取各組3 h點的胰腺組織制作電鏡標本，采用JEOL-1200EX透射電鏡觀察，MORADA-G2記錄。隨機選取10個不同的視野，記錄每個視野下自噬體和自噬溶酶體的數(shù)量。(4)免疫組織化學染色：組織切片經(jīng)免疫組織化學染色，隨機觀察5個不重復的高倍視野。免疫組化評分由陽性染色深度評分乘以陽性細胞比率評分得出。

二、結(jié)果

1．胰腺組織病理學改變：光鏡下觀察，SO組胰腺無明顯病理變化。AEP 3 h點可見局部葉間隙水腫，少量炎癥細胞浸潤，6、12 h點可見彌漫性葉間隙水腫，小葉分離，腺泡間隙增寬，大量炎癥細胞浸潤，偶見少量出血。ANP組可見灶狀或大片狀壞死，腺泡結(jié)構(gòu)破壞，炎癥細胞及紅細胞浸潤，并隨時間延長而加重。AEP組病理損傷評分較SO組顯著增加，ANP組評分又較AEP組顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義。AEP組6、12 h點評分較3 h點顯著增加(P<0.05)，但6、12 h點之間差異無統(tǒng)計學意義。ANP組損傷評分隨時間延長而增加，各時間點差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。

表1 各組不同時間點胰腺組織病理評分

注：與SO組比較，aP<0.05；與AEP組比較，bP<0.05；與3 h AEP組比較，cP<0.05；與6 h ANP組比較，dP<0.05

2．血淀粉酶水平變化：AEP組、ANP組血清淀粉酶水平均較SO組明顯升高。

3．胰腺組織超微結(jié)構(gòu)改變：造模后3 h SO組細胞核核膜較完整，細胞器形態(tài)正常，偶見自噬溶酶體和自噬體；AEP組可見線粒體腫脹，并見較多自噬溶酶體和自噬體；ANP組見線粒體腫脹，內(nèi)膜損傷明顯，并可見較多自噬溶酶體和自噬體。每個電鏡視野AEP組自噬體與自噬溶酶體為(3.90±1.60)個，ANP組為(7.10±2.56)個，均較SO組中(1.40±1.17)個數(shù)量增加(P<0.05)，ANP組又較AEP組增加(P<0.05，圖1)。

圖1 SO組(1A)、AEP組(1B)、ANP組(1C)自噬體與自噬溶酶體電鏡圖(×15000)

4．胰腺組織LC3B、p62蛋白表達量變化：LC3B蛋白主要表達在腺泡細胞胞質(zhì)和胰島細胞胞質(zhì)中，p62蛋白表達在腺泡細胞、胰島細胞胞質(zhì)。SO組各時間點可見LC3B及p62少量表達，且各時間點之間的差異無統(tǒng)計學意義；AEP組、ANP組LC3B及p62表達均較SO組顯著增強，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。AEP組6、12 h點LC3B表達較3 h點明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而6、12 h點LC3B表達及各時間點p62表達的差異無統(tǒng)計學意義。ANP組LC3B表達隨著時間的延長而增加，各時間點的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2，圖2)，而各時間點p62表達無明顯變化。

討論自噬是細胞內(nèi)細胞器以及其他結(jié)構(gòu)的減員和自然更新的途徑，但其功能損傷時可引起一系列的病理反應[5]。自噬過程被ATG基因所調(diào)控。LC3是哺乳動物細胞中酵母ATG8基因的同源物，LC3分為Ⅰ(A)型和Ⅱ(B)型。自噬發(fā)生時LC3-Ⅰ經(jīng)過與自噬膜結(jié)合合成LC3-Ⅱ。因為LC3-Ⅱ始終結(jié)合在自噬體的膜上,所以其含量的多少與自噬體數(shù)量的多少呈正比[6-7]。p62(又名SQSTM1)是一種泛素結(jié)合蛋白，可與LC3-Ⅱ形成復合物，并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入自噬溶酶體中，然后被降解。p62水平與自噬的活性呈反比，是檢測自噬活性的一個標志蛋白[8]。通過對LC3檢測可以評價自噬體的數(shù)量，對p62檢測可以評估自噬的活性。

表2 各組LC3B、p62評分

注：與SO組比較，aP<0.05；與AEP組比較，bP<0.05；與3 h AEP組比較，cP<0.05；與6 h ANP組比較，dP<0.05

圖2 SO組(2A)，AEP組3、6、12 h(2B、2C、2D)，ANP組3、6、12 h(2E、2F、2G)LC3B(上)和p62(下)表達(×200)

本研究結(jié)果顯示，AEP組、ANP組與SO組比較，LC3B表達明顯增加，且隨病理損傷的加重而增加，ANP組與AEP比較，LC3B的表達量也明顯增加。此外在電鏡下也發(fā)現(xiàn)AEP和ANP組中自噬體和自噬溶酶體數(shù)目明顯增多。說明自噬在AP中表達是增強的。

本結(jié)果顯示，p62蛋白在SO組未見積累，在AEP組和ANP組p62開始積累，但AEP組和ANP組中各時間點的積累無明顯變化。電鏡下觀察到AEP組和ANP組線粒體腫脹，其中ANP中可見線粒體損傷明顯。既然在AP中自噬是增加的，那么底物蛋白p62也應該不斷的被降解，但結(jié)果恰好相反，可以解釋為自噬的降解水平降低了，表明自噬的功能受損。另外Mareninova等[2]同樣發(fā)現(xiàn)與饑餓時相比，胰腺炎中自噬的效率減低，使降解受抑制。

本研究的缺陷在于僅僅發(fā)現(xiàn)AP中自噬損傷的現(xiàn)象，但自噬損傷的機制并不明確，需要進一步對自噬通路以及自噬與胰酶激活關(guān)系進行研究。

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10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.06.011

國家自然基金項目(81560112)

518172 廣東深圳，深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院消化科(蘇濤)；南昌大學第一附屬醫(yī)院(蘇濤、劉丕、柯華婧、楊曉娟、李驥)

劉丕，Email:liupi1974@sina.com

2016-08-15)

冀凱宏)