胰腺癌動物學模型研究現狀

錢偉琨 段萬星 馬清涌

胰腺癌動物學模型研究現狀

錢偉琨 段萬星 馬清涌

(馬清涌，西安交通大學第一附屬醫院教授、主任醫師、博士生導師。中國抗癌協會胰腺癌專業委員會、CSCO胰腺癌專家委員會、中華醫療保健國際交流促進會胰腺疾病分會委員、中國醫藥教育協會腹部腫瘤專業委員會常務委員。中華胰腺病學雜志及多本專業雜志編委。主要研究方向胰腺疾病的基礎及臨床應用研究。培養博士55名，已畢業42名。發表論文200余篇，包括SCI論文130余篇。獲陜西省科學技術二等獎三項。)

現階段，胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)研究主要應用的動物模型可以分為移植瘤模型、基因工程鼠模型以及近年來興起的類器官模型[1]等。動物模型具有動物體型小、繁殖迅速、壽命長(3年)等特點，可以更加真實地反映腫瘤在生物體內發生、發展、轉移和耐藥等情況，故對于PDAC發生的分子機制研究、抗腫瘤藥物篩選等具有重要的意義。

一、移植瘤模型

PDAC移植瘤模型有很多種，按移植部位可分為皮下移植瘤和胰腺原位移植瘤模型；按移植物來源可分為同種移植瘤和異種移植瘤模型，后者又按移植物種類分為基于人腫瘤細胞構建的細胞移植瘤模型和基于人腫瘤組織構建的異種移植瘤(patient-derived tumour xenografts，PDXs)模型。PDAC移植瘤模型較體外細胞模型的優勢在于能更加真實、系統地模擬腫瘤在生物活體內生長情況，反映生物體營養、代謝、免疫狀況等對腫瘤發生、生長、轉移、耐藥等方面的影響，較基因工程鼠模型造價低、操作簡便、成瘤周期短。

細胞移植瘤模型是將人腫瘤細胞移植入免疫缺陷鼠皮下或胰腺原位，其缺陷在于移植物來源較為單一(常為一種腫瘤細胞)，代表性不足。PDAC是一種高度異質性的腫瘤，表現為腫瘤細胞成分及來源多樣，間質成分多樣，甚至在不同個體或同一個體不同時期呈現多樣性。全基因組測序證實，不同個體之間或同一個體的原發腫瘤和轉移灶之間，PDAC具有很強的遺傳多樣性[2]。研究表明，豐富的基質纖維化反應是PDAC的一個顯著特征，PDAC腫瘤組織中腫瘤細胞占比較少，其周圍包繞著大量的主要由胰腺星狀細胞(pancreatic stellate cells, PSCs)產生的細胞外基質(extracellular matrix，ECM)[2]和各種非腫瘤細胞例如間質細胞、免疫細胞、血管細胞等。為了更好地模擬出更真實的PDAC，本課題組將BxPC-3細胞和PSCs以5∶1比例混合制成單細胞懸液，注入Balb/c裸鼠皮下(100 μl)或胰腺原位(30 μl)成功構建了PDAC間質纖維化移植瘤模型[3]。

PDXs模型則是將新鮮的PDAC切除標本碎片移植入免疫缺陷鼠皮下或胰腺原位，可以較細胞移植瘤模型更真實地反映出包括PDAC在內的許多腫瘤的抗腫瘤藥物應答反應[4]。PDXs的缺陷在于構建周期長且對腫瘤組織的特性要求較高(如需要侵襲性高的腫瘤組織)，不適用于PDAC這種生存期短、手術機會較少的癌癥。此外，PDXs的腫瘤組織在連續傳代的過程中，其分子和組織學特性會發生改變[5]。

PDAC移植瘤模型的局限性還體現在皮下移植瘤模型是將腫瘤細胞或組織塊植入血供較為豐富、藥物灌注良好的受體皮下組織，故其不能模擬出真實的PDAC的乏血供、低藥物灌注狀態[6]，因此對PDAC轉移的研究價值相對較低[7]。此外，免疫系統與腫瘤的相互作用可影響PDAC的發生發展，如癌細胞可以表達PD-L1，并與CD8+細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic lymphocyte， CTL)表面的PD-1結合以抑制其遷移活化，從而減少CTL對腫瘤細胞的識別殺傷，與腫瘤進展及不良預后相關[8]；又如M2型巨噬細胞與胰腺癌的腫瘤免疫抑制和不良預后相關[9]等。為防止免疫排斥而使移植失敗，移植受體主要選用不同類型的免疫缺陷鼠，這就造成了PDAC移植瘤模型缺少了免疫系統與腫瘤之間的相互影響。這些局限性可能是造成以移植瘤模型為載體的基礎實驗結果與臨床試驗結論不相符的原因所在。

二、基因工程鼠模型

由正常胰腺上皮演變為癌組織，至少需要發生4～5個基因突變事件[10]。胰腺癌的發生和發展過程中有4個主要的基因：K-ras、CDKN2A、Trp53和Smad4[11]。K-ras基因是PDAC最常見的突變基因之一，抑癌基因Trp53也影響PDAC的發生發展。LSL-KrasG12D；Pdx1-Cre(KC)、LSL-KrasG12D；LSL-Trp53R172H；Pdx1-Cre(KPC)[12-13]，即基于K-ras癌基因突變和(或)聯合Trp53抑癌基因突變所構建的基因工程鼠模型是現階段研究較為常用的PDAC動物模型，它可以很好地模仿PDAC的病理生理發展過程。構建KC/KPC鼠是借助一種條件基因打靶技術——Cre-LoxP系統。先利用基因工程技術構建一種表達載體(核心部件為被LoxP-Stop-LoxP序列錨定的目的基因，如LSL-KrasG12D、LSL-Trp53R172H)，其次將其導入預先獲得的鼠胚胎細胞，應用同源重組技術將載體整合入胚胎細胞基因組中，并對其進行篩選，然后將整合有目的基因的鼠胚胎細胞重新導入鼠胚胎使其發育成為成熟的嵌合體鼠，最后使之與野生型鼠雜交得到含目的基因的雜合子鼠。此外，還需應用上述基因工程技術和雜交技術獲得帶胰腺特異性啟動子-Cre酶(如Pdx1-Cre)的雜合子鼠，二者雜交形成最終的基因工程鼠模型。此模型的胰腺組織特異性表達Cre酶，識別切割LoxP-Stop-LoxP序列使目的基因得以表達。KC鼠可以很好地模擬胰腺正常腺泡→ADM→PanINs(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)的變化，腫瘤進展較為緩慢，其中位生存期在1年左右，因此它常用于腫瘤的發生、早期診斷和預防方面的研究。KPC鼠可以很好地模擬正常胰腺組織→PDAC甚至轉移癌的過程，腫瘤進展相對迅速，其中位生存期在5個月左右，且其組織學形態表現為基質成分豐富且乏血供[10]，對PDAC常規化療藥物吉西他濱具有耐藥性[14]，主要用于PDAC的生長、轉移、耐藥、腫瘤免疫等方面的研究。KPPC鼠為抑癌基因Trp53純合子突變鼠，其腫瘤進展迅速，腹水、黃疸、局部浸潤及遠處轉移均較KPC模型嚴重且快速，中位生存期僅2個月左右[15]。

其他PDAC基因工程鼠模型如Garcia-Carracedo等[16]通過構建MT-TGFα、Smad4f/f；p48-Cre (S4)、Smad4f/f；MT-TGFα、p48-Cre (STP)3種模型，顯示Smad4缺失和TGF-α高表達可促進PDAC的轉移、PanINs的發展以及纖維化過程。Gruber等[17]通過構建R26-LSL-YFP、LSL-KrasG12D、±Yapf/f、±Tazf/f、±Stat3f/f、Ela1-CreERT2模型，表明PDAC的主要細胞學來源是胰腺腺泡細胞，而非導管細胞或泡心細胞，提出了腫瘤的命名方式應該由其來源確定而非后期形態來確定的理念?？傊蚬こ淌竽Ｐ偷膬瀯輿Q定了其在PDAC研究中的核心地位，但局限性在于設計難度大、操作復雜、構建困難、造價昂貴，故其廣泛應用仍受到一定程度的限制。

三、類器官模型

Boj等[1]在前人研究的基礎上開發出PDAC類器官模型。首先取小葉內導管細胞(來自野生型小鼠正常胰腺組織和KC鼠PanINs-1a/b胰腺組織)包埋入人工基底膜進行3D培養，然后將其原位移植入小鼠胰腺。結果野生型小鼠構建的模型表現為正常胰腺導管結構，KC鼠構建出PDAC類器官模型。應用人正常胰腺和人PDAC，也獲得了人源性腫瘤組織構建的PDAC類器官模型。

PDAC類器官模型的優勢在于該模型能夠高度模仿人PDAC完整的病理生理發展過程(包括各種級別的PanINs、侵襲性PDAC以及轉移瘤)，還可以觀察到類似于人和基因工程鼠模型中的PDAC的膠原沉積[1,6]。應用類器官模型可以在體內研究人PanINs的結構、早期標志物，從而進一步研究PDAC早期診斷與治療技術。

四、結語

應用PDAC動物模型可以更加真實地反映人PDAC的病理生理發展過程和分子機制，對揭示促進PDAC快速進展的因素、探索非手術治療方案、改善胰腺癌預后具有重要意義。從移植瘤模型到基因工程鼠模型再到類器官模型，每種模型都有其自身的優勢和局限，要求我們在進行PDAC的研究時，一方面要選擇恰當的模型進行合適的研究得出合理的結論，揚長避短，最大限度地減小實驗誤差和偏倚，另一方面要不斷完善PDAC模型，為PDAC的基礎研究創造最符合真實情況的工具。只有這樣，才能更加清楚、準確地認識PDAC，為PDAC的醫學轉化研究提供理論基礎。

[1] Boj SF, Hwang CI, Baker LA, et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer[J]. Cell, 2015,160(1-2):324-338. DOI: 10.1016/j.cell.2014.12.021.

[2] Jones S, Zhang X, Parsons DW, et al. Core signaling pathways in human pancreatic cancers revealed by global genomic analyses[J]. Science, 2008,321(5897):1801-1806. DOI: 10.1126/science.1164368.

[3] Duan W, Chen K, Jiang Z, et al. Desmoplasia suppression by metformin-mediated AMPK activation inhibits pancreatic cancer progression[J]. Cancer Lett, 2017,385:225-233. DOI: 10.1016/j.canlet.2016.10.019.

[4] Garber K. From human to mouse and back: ‘tumorgraft’ models surge in popularity[J]. J Natl Cancer Inst, 2009,101(1):6-8. DOI: 10.1093/jnci/djn481.

[5] Aparicio S, Hidalgo M, Kung AL. Examining the utility of patient-derived xenograft mouse models[J]. Nat Rev Cancer, 2015,15(5):311-316. DOI: 10.1038/nrc3944.

[6] Olive KP, Jacobetz MA, Davidson CJ, et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer[J]. Science, 2009,324(5933):1457-1461. DOI: 10.1126/science.1171362.

[7] Pothula SP, Xu Z, Goldstein D, et al. Key role of pancreatic stellate cells in pancreatic cancer[J]. Cancer Lett, 2016,381(1):194-200. DOI: 10.1016/j.canlet.2015.10.035.

[8] Nomi T, Sho M, Akahori T, et al. Clinical significance and therapeutic potential of the programmed death-1 ligand/programmed death-1 pathway in human pancreatic cancer[J]. Clin Cancer Res, 2007,13(7):2151-2157. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-06-2746.

[9] Witkiewicz A, Williams TK, Cozzitorto J, et al. Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma recruits regulatory T cells to avoid immune detection[J]. J Am Coll Surg, 2008,206(5):849-854. DOI: 10.1016/j.jamcollsurg.2007.12.014.

[10] Fearon ER, Vogelstein B. A genetic model for colorectal tumorigenesis[J]. Cell, 1990,61(5):759-767.

[11] Kamisawa T, Wood LD, Itoi T, et al. Pancreatic cancer[J]. Lancet, 2016,388(10039):73-85. DOI: 10.1016/S0140-6736(16)00141-0.

[12] Hingorani SR, Petricoin EF, Maitra A, et al. Preinvasive and invasive ductal pancreatic cancer and its early detection in the mouse[J]. Cancer Cell, 2003,4(6):437-450.

[13] Hingorani SR, Wang L, Multani AS, et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice[J]. Cancer Cell, 2005,7(5):469-483. DOI: 10.1016/j.ccr.2005.04.023.

[14] Jacobetz MA, Chan DS, Neesse A, et al. Hyaluronan impairs vascular function and drug delivery in a mouse model of pancreatic cancer[J]. Gut, 2013,62(1):112-120. DOI: 10.1136/gutjnl-2012-302529.

[15] Morton JP, Timpson P, Karim SA, et al. Mutant p53 drives metastasis and overcomes growth arrest/senescence in pancreatic cancer[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010,107(1):246-251. DOI: 10.1073/pnas.0908428107.

[16] Garcia-Carracedo D, Yu CC, Akhavan N, et al. Smad4 loss synergizes with TGFα overexpression in promoting pancreatic metaplasia, PanIN development, and fibrosis[J].PLoS One,2015,10(3):e0120851. DOI: 10.1371/journal.pone.0120851.

[17] Gruber R, Panayiotou R, Nye E, et al. YAP1 and TAZ control pancreatic cancer initiation in mice by direct up-regulation of JAK-STAT3 signaling[J]. Gastroenterology, 2016,151(3):526-539. DOI: 10.1053/j.gastro.2016.05.006.

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.06.002

國家自然科學基金(81672434、81472248)

710061 西安，西安交通大學第一附屬醫院肝膽外科

馬清涌，Email: qyma56@xjtu.edu.cn

2017-01-25)

呂芳萍)