基于RNA-seq技術的宮頸癌與癌旁組織差異表達基因分析

張志珊 蔣燕成 陳紫萱 陳婉花 李愛祿 李純孝

·基礎研究·

基于RNA-seq技術的宮頸癌與癌旁組織差異表達基因分析

張志珊 蔣燕成 陳紫萱 陳婉花 李愛祿 李純孝

目的探討宮頸癌的發病機制。方法應用RNA-seq技術分析3對宮頸癌及癌旁組織轉錄組，利用生物信息方法對差異基因進行基因本體(GO)分析和通路富集性分析。結果在宮頸癌組織中發現1755個差異表達基因，其中758個基因表達上調，997個基因表達下調。功能富集分析表明，差異基因富集于細胞粘附、DNA損傷有關的信號通路上。且宮頸癌組織中發現RAB22A-BCAS1等融合基因。結論細胞粘附信號通路、RAB22A-BCAS1融合基因可能與宮頸癌的發生機制有關。

宮頸癌；RNA-seq；轉錄組；差異表達基因；融合基因

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，人乳頭狀瘤病毒(HPV)的感染是引起宮頸癌的重要因素，但并非所有感染HPV的患者都會發展為宮頸癌，只有HPV持續感染導致細胞的基因組異常才最終導致宮頸癌的發生。本研究擬收集福建醫科大學附屬泉州第一醫院婦科就診的宮頸癌患者3例，采用RNA-Seq技術分析宮頸癌組織與癌旁組織的轉錄組，篩選出差異表達基因，進而分析差異表達基因所涉及的信號通路以及融合基因表達，有利于闡明宮頸癌的發病機制，尋找宮頸癌特異的分子標志物，同時也為基因藥物的開發提供候選的藥物作用靶點。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集福建醫科大學附屬泉州第一醫院婦科就診的宮頸癌患者3例，術前經未經放化療及藥物治療，經病理組織學確診為宮頸癌ⅡB期，同時取癌組織和癌旁組織(距離宮頸癌癌灶邊緣>3 cm)，置于RNA保存液中-80 ℃保存。

1.2 RNA提取及質檢

3對癌組織及癌旁組織分別用QIAGEN微量RNA提取試劑盒按操作說明書提取RNA。瓊脂糖凝膠電泳分析 RNA 的純度和完整性，Nanodrop 檢測 RNA 的純度(OD 260/280 比值)，Qubit 2.0對RNA濃度進行精確定量，Agilent 2100精確檢測RNA的完整性。

1.3 文庫構建及測序

用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物 mRNA，加入 fragmentationbuffer 將 mRNA 打斷成短片段，以 mRNA 為模板，用六堿基隨機引物(random hexamers)合成一鏈 cDNA，加入緩沖液、dNTPs 和 DNA polymerase I 和RNase H 合成二鏈 cDNA，利用 AMPure XP beads 純化雙鏈 cDNA。純化的雙鏈 cDNA 先進行末端修復、加 A 尾并連接測序接頭，再用 AMPure XPbeads 進行片段大小選擇。采取PCR 擴增，用 AMPure XP beads 純化 PCR 產物，得到文庫。文庫構建完成后，先使用 Qubit 2.0 進行初步定量，稀釋文庫，使用 Agilent 2100 對文庫的插入片段進行檢測，使用 Q-PCR 方法對文庫的有效濃度進行準確定量，保證文庫質量。文庫檢測合格后，使用 Illumina 高通量測序平臺(HiSeq/MiSeq)進行測序。

1.4 測序數據分析

測序數據的質量主要分布在Q30以上，才能保證后續高級分析的正常進行。將原始數據中包含的接頭(adapter)信息、低質量堿基、未測出的堿基去除，得到最終的有效數據(clean data)。利用TopHat2軟件將獲得的數據與參考基因組進行序列比對，比對到指定的參考基因組上的Reads稱為Mapped Reads，利用Cufflinks軟件將Mapped Reads 進行轉錄本拼接，利用Cufflinks軟件計算癌組織和癌旁組織基因表達量。

1.5 差異表達基因篩選

應用CuffDiff軟件進行分析，在不同樣本組差異表達RNA檢測過程中，將Fold Change≥2且FDR<0.05作為篩選標準。差異倍數(Fold Change)表示兩樣品間表達量的比值。

1.6 差異表達基因通路富集及基因本體(GO)分析

應用信號通路分析軟件(IPA)對2組樣本差異表達基因進行信號通路富集、疾病功能富集分析，利用軟DAVID工具進行GO分析。

1.7 融合基因分析

應用TopHat fusion分析融合基因，tophat fusion通過將未能比對到參考基因組的reads打碎成25 bp的片段，然后采用Bowtie將25 bp的片段比對到基因組，從而找出比對到兩個染色體的片段或者比對到同一染色體不同位置的reads。

2 結果

2.1 差異表達基因分析

將癌組織和癌旁組織相比，共發現1755個差異表達基因，癌組織相對于癌旁組織樣本中有758個基因表達量上調，997個基因表達量下調。

2.2 GO及通路分析

1755個差異基因共富集到582條GO_BP，1755個差異表達基因共富集到378條通路。這些差異表達的基因主要涉及粘附、DNA損傷等通路。最有意義的前5條信號通路富集結果如表1所示。

表1 癌組織和癌旁組織差異表達基因前5條信號通路富集結果

2.3 融合基因

分析癌組織中存在的融合基因，分析結果及說明見表2。

表2 融合基因分析結果及說明

3 討論

雖然高危型HPV的持續感染是引起宮頸癌的根本原因，但僅有一小部分感染者發展為宮頸癌[1]。目前眾多研究證實宮頸組織基因水平上表達異常會誘發宮頸癌的發生[2]。RNA-Seq技術不僅能檢測組織已知基因的轉錄活動，還能檢測未知基因[3]。

本研究中收集福建醫科大學附屬泉州第一醫院婦科就診的宮頸癌患者3例，采取RNA-Seq技術，共發現1755個差異表達基因，共富集到582條GO種類和378條通路，這些差異表達的基因主要涉及粘附、DNA損傷等通路。排在前2位的通路均與細胞粘附和滲出有關，而細胞粘附分子在細胞的粘附與滲出中起重要的作用。研究顯示細胞粘附分子與宮頸癌的侵襲轉移有密切關系。在宮頸癌的形成、發展和轉移過程中，細胞粘附分子起著至關重要的作用[4]。活化白細胞粘附分子在不同惡變程度宮頸癌中的表達存在差異，并在宮頸癌的發生發展過程中表達量呈上升趨勢[5]。因此我們推測與細胞粘附相關的信號通路可能在宮頸癌的發生中起一定的作用。

融合基因是指兩個基因的編碼區首尾相連構成的嵌合基因。融合基因編碼的蛋白通常具有致癌性，會影響細胞的正常生理功能，是導致癌癥的主要原因之一。目前，在肺癌、甲狀腺、乳腺癌等疾病中，都發現了融合基因的存在[6-7]，但是與宮頸癌的相關性尚未見報道。本研究通過RNA-Seq技術檢測宮頸癌組織和癌旁組織的轉錄組發現，與癌旁組織相比，3個宮頸癌組織中都存在不同程度的融合基因。其中RAB22A-BCAS1融合基因有2個宮頸癌樣本中同時存在。RAB22A是ras相關的小G蛋白家族成員，是囊泡運輸重要的調節因子。RAB22A在包括肝癌、黑色素瘤、卵巢癌、骨肉瘤在內的多種腫瘤中過表達[8-9]。乳腺癌擴增序列-1 (BCAS1) 位于20q13.2區域，BCAS1高表達在乳腺癌浸潤和轉移中發揮重要的作用[10]，BCAS1還參與三陰乳腺癌的發生[11]。此外，有研究表明，BCAS1還與前列腺癌、胃食管連接處腺癌、胰腺癌相關[12]。RAB22A、BCAS1與宮頸癌的相關性尚未見報道，而RAB22A-BCAS1融合基因以及本研究中發現的其他融合基因是否為導致宮頸癌的潛在致癌基因，在后續的研究中，我們將擴大樣本量進行進一步的驗證。

綜上所述，我們通過高通量RNA-Seq技術分析宮頸癌及癌旁轉錄組，發現1755個差異表達基因，這些差異表達基因富集到與細胞粘附、DNA損傷等信號通路上，且發現了RAB22A-BCAS1等融合基因，推測可能與宮頸癌的發生、發展相關，為后續進一步研究宮頸癌的發生機制提供了新的方向和思路。

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AnalysisofDifferentlyExpressedGenesofTumorandAdjacentNon-tumorTissuesfromPatientswithCervicalCancerbyRNASequencing

ZHANGZhishan,JIANGYancheng,CHENZixuan,etal.

QuanzhouFirstHospital，FujianMedicalUniversity,Quanzhou,362000

ObjectiveTo explore the possible pathogenesy of cervical cancer.MethodsRNA sequencing was performed to screen the differently expressed genes of 3 pairs of cervical carcinoma and matched adjacent non-tumor tissues.The differently expressed genes were identified with gene ontology (GO) analysis and pathway enrichment analysis.ResultsThere were a total of 1755 differently expressed genes in the samples,including 758 up-regulated genes and 997 down-regulated genes.These differently expressed genes were enriched in pathway related to cell adhesion and DNA damage.Moreover,RAB22A-BCAS1 fusion gene was found in cervical cancer tissues.ConclusionThe pathway of cell adhesion and RAB22A-BCAS1 fusion gene may be related to the tumorigenesis and development of cervical cancer.

Cervical carcinoma;RNA-seq;Transcriptome;Differently expressed gene;Fusion gene

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1915～1917)

福建省自然科學基金(編號：2014J01436)

362000 福建醫科大學附屬泉州第一醫院

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.12.001

R737.33

A

1001-5930(2017)12-1915-03

2017-06-22

2017-07-10)

(編輯：吳小紅)