血漿游離DNA在非小細胞肺癌診斷中的價值

杜潔 隋永杰 李紅艷 王水利

·論著·

血漿游離DNA在非小細胞肺癌診斷中的價值

杜潔 隋永杰 李紅艷 王水利

目的探討血漿游離DNA水平在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中的診斷價值。方法選取陜西省人民醫院健康中心120例健康對照者，并提取收治呼吸內科的116例非小細胞肺癌患者的，采用熒光定量PCR方法檢測血漿游離DNA水平。結果非小細胞肺癌組患者的血漿游離DNA水平為200.70±88.54 ng/ml，健康對照組的血漿游離DNA水平為18.65±6.30 ng/ml，組間比較差異有統計學意義(P<0.01)；Ⅰ/Ⅱ期非小細胞肺癌患者的血漿游離DNA水平為172.75±72.87 ng/ml，Ⅲ/Ⅳ期非小細胞肺癌血漿游離DNA水平為221.88±93.86 ng/ml，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。血漿游離DNA水平與患者的年齡、性別、吸煙狀況及組織學類型無明顯相關性(P>0.05)。結論血漿游離DNA是一種新發現的腫瘤標志物，可作為非小細胞肺癌早期診斷和臨床分期的有效工具。

非小細胞肺癌； 血漿游離DNA； 早期診斷； 腫瘤標志物

肺癌是目前全球發病率及死亡率最高的惡性腫瘤之一，對人類健康已構成嚴重威脅[1]。肺癌構成比中約85%為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)，且約有70%的NSCLC患者發現時已確診為肺癌晚期[2]，其生存率顯著下降。因此，早期診斷是提高NSCLC治療效果的重要措施和手段。近年來有研究表明，腫瘤組織不斷生長并釋放DNA進入外周血成為血漿游離DNA，其與腫瘤細胞的基因組DNA遺傳特性相同，有望成為新的潛在腫瘤標志物，從而為腫瘤的早期診斷提供新的思路和方法[3]。本研究通過熒光定量PCR檢測NSCLC患者的血漿游離DNA，評估其在NSCLC患者診斷中的應用價值。

資料與方法

一、一般資料

入選病例為2015年12月至2016年12月陜西省人民醫院呼吸內科就診的116例NSCLC患者(NSCLC組)，包括女52例，男64例；年齡范圍41～78歲，平均年齡(58.6±10.5)歲。所有患者均經細胞學或病理學檢查確診為NSCLC，其中腺癌60例，鱗癌56例。根據國際抗癌聯盟(union for international cancer control, UICC)2009年公布的第7版肺癌TNM分期標準對所有NSCLC患者進行TNM分期。患者血標本采集前均未行手術、放療及化療等相關抗腫瘤治療。排除標準：病毒性肝炎、HIV等病毒感染性疾病、自身免疫性疾病及嚴重肝腎損害性疾病。同時收集本院120例健康體檢者作為對照組，包括女59例，男61例，年齡范圍38～79歲，平均年齡57.4歲。所有研究對象均知情同意。研究獲院倫理委員會批準。

二、研究方法

1. 外周血樣本的采集： 抽取所有受檢者空腹靜脈血約5 ml，采用離心機離心10 min (20 ℃，離心半徑8 cm，3 000 r/min)，吸取血漿上清部分轉移至2 ml無菌EP管中，采用低溫高速離心機離心10 min(4 ℃，離心半徑8 cm，12 000 r/min)，取血漿上清以1 ml/管分裝，最后放置于-80 ℃冰箱凍存備用，操作過程在2 h內完成。

2. 血漿游離DNA的提取： 采用QIAamp DNA Blood Midi Kit (Qiagen公司，德國)試劑盒嚴格按照操作步驟說明進行血漿DNA的提取。取血漿樣本500 μl，依次調制50 μl蛋白酶、500 μl Buffer AL及500 μl乙醇，最后加入50 μl的 Buffer AE洗脫液。將提取到的血漿游離DNA放置于-20 ℃冰箱保存備用。

3. 血漿游離DNA水平的測定： ①參考Yoon文獻[4]中的β-actin引物序列:上游引物5′-CCACACTGTGCCCATCTACG-3′，下游引物5′-AGGATCTTCATGAGGTAGTCAGTCAG-3′，擴增產物長度99 bp，引物序列由上海工生物工程技術服務有限公司提供；②將DNA模板以及所有DNA樣品分別配置RT-PCR反應體系，總反應體系為20 μl，包括熒光PCR反應液(SYBR Premix Ex Taq) 11 μl，1 μmol/L上、下游引物各1 μl，DNA模板1 μl，ddH2O 6 μl。根據引物序列設置循環參數: 95 ℃、1 min，95 ℃、20 s，60 ℃、30 s，68 ℃、45 s，共40個循環。

4. 標準曲線繪制及DNA水平計算： 用已知濃度的DNA標準品得到的ct值繪制標準曲線，見圖1。ct值與DNA含量的對數呈線性關系，采用PCR儀自帶的分析軟件根據樣品中的ct值得到樣品濃度。分析NSCLC組患者的血漿游離DNA水平與臨床參數及組織學類型之間的關系。

圖1 標準曲線圖

三、統計學方法

結 果

一、NSCLC組和健康對照組之間血漿游離DNA水平的比較

研究結果表明，NSCLC組的血漿游離DNA水平為(200.70±88.54)ng/ml，明顯高于健康對照組的血漿游離DNA水平(18.65±6.30)ng/ml，兩組之間比較差異有統計學意義(P<0.01)。

二、NSCLC組患者的血漿游離DNA水平與臨床相關參數及組織學類型的相關性

NSCLC組患者的血漿游離DNA水平與性別、年齡、吸煙狀況及組織學類型均無明顯相關性(P>0.05)，與臨床分期存在相關性(P<0.05)，NSCLC患者血漿游離DNA水平與臨床參數及組織學類型的關系，見表1。

表1 NSCLC患者血漿游離DNA 水平與臨床參數及組織學類型的關系 (ng/ml)

討 論

目前，臨床上常見的肺癌診斷方法主要包括血清腫瘤標志物檢測、痰脫落細胞學檢查、纖維支氣管鏡檢查、肺穿刺活檢及影像學等相關檢查，然而在特異度、靈敏度或患者依從性方面都還存在一些局限性。

游離DNA存在于循環系統中的結論已經被證實，它是含有DNA雙螺旋結構的核苷酸片段，長度為160～200個堿基對，與細胞凋亡后經酶降解產生的核小體加上一個連接片段的長度大致相同，說明游離DNA可能多系細胞凋亡所產生[5]。健康人血漿中存在少量游離DNA，而腫瘤患者的血漿游離DNA水平顯著升高，約為健康人的10倍以上，其來源主要是[6]：①腫瘤細胞或微轉移灶；②腫瘤細胞凋亡及壞死；③腫瘤細胞自身釋放DNA。隨著DNA從腫瘤組織中釋放進入血液，導致血漿游離DNA水平顯著升高。游離DNA可以出現與原發腫瘤DNA相同的遺傳特征或基因改變, 兩者有著共同的遺傳特性，進一步研究表明游離DNA與腫瘤的發生、生展有著重要的相關性[7-8]。

與臨床常用的五項血清腫瘤標志物(CEA、CA125、NSE、CYFRA21-1、SSC-Ag)相比，血漿游離DNA對肺癌檢測的陽性率比單一腫瘤標志物檢測高得多，且和五項血清腫瘤標志物聯合檢測的總陽性率相接近。另有學者認為，當血漿游離DNA聯合血清五項腫瘤標志物(CEA、CA125、NSE、CYFRA21-1、SSC-Ag)共同對肺癌進行檢測時，診斷的靈敏度可顯著提高[9]。Newman等[10]研究發現血漿游離DNA對Ⅱ～Ⅳ期NSCLC患者檢測的靈敏度為100%，對Ⅰ期NSCLC患者檢測的靈敏度為50%；對各期NSCLC患者檢測的特異度均為96%。

本研究結果顯示，NSCLC組患者的血漿游離DNA水平明顯高于健康對照組(P<0.01)，與Ulivi等[11]研究報告的結果一致。NSCLC組患者的血漿游離DNA水平具有較高的區分度，提示血漿游離DNA有可能作為NSCLC早期診斷的腫瘤標志物。并且外周血樣本取材相對容易、微創或無創，血漿游離DNA檢測猶如“液體活檢”，是一種方便、快捷的分子生物學檢測手段[12]。血漿游離DNA水平在NSCLC組患者的性別、年齡及吸煙狀況中作比較，差異無統計學意義(P>0.05)，提示患者的性別、年齡及吸煙狀況對血漿游離DNA的釋放可能無影響。通過分析NSCLC不同組織學類型的血漿游離DNA水平發現，腺癌患者和鱗癌患者的血漿游離DNA水平之間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。Szpechcinski等[13]研究也指出，血漿游離DNA水平在不同組織學類型上無顯著差異。然而鄧水秋等[14]的研究結論卻不相同，稱血漿游離DNA水平在腺癌患者中明顯高于鱗癌患者。考慮結論不相同的原因可能與研究樣本例數較少、DNA提取方法不同或不同組織學類型存在增殖動力學差異有關，但仍有待進一步驗證。本研究結果提示血漿游離DNA水平在Ⅲ/Ⅳ期NSCLC患者中明顯高于Ⅰ/Ⅱ期NSCLC患者，與肺癌臨床分期存在相關性(P<0.05)，這一結果與Madhavan等[15]研究結論相一致。其原因可能是Ⅲ/Ⅳ期NSCLC患者腫瘤負荷量較大，腫瘤細胞數量較多，凋亡、壞死幾率較大及釋放量增多，從而導致中晚期NSCLC患者的血漿游離DNA水平顯著升高，提示根據NSCLC患者的血漿游離DNA水平有可能成為判斷患者生存及預后的有效方法[16-20]。

綜上所述，盡管游離DNA與其他肺癌血清標志物相比具有明顯的優勢，但是該研究尚處于初級階段，仍然具有一定的局限性。另外，血漿游離DNA水平的檢測還有賴于靈敏度高、特異性強的現代化標準檢測手段。血漿游離DNA水平與NSCLC的發生、發展密切相關，是一種潛在的有價值的生物學標志物，其量化可成為臨床上NSCLC早期診斷和腫瘤分期的工具，為評估疾病的嚴重程度及判斷患者預后提供更加準確的信息。

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ValueofplasmafreeDNAinthediagnosisofnon-smallcelllungcancer

DuJie,SuiYongjie,LiHongyan,WangShuili.

Medicalexaminationcenter,ShanxiProvincialPeople′sHospital,Xi′an710068,China

DuJie,Email:dujie123._@163.com

ObjectiveTo evaluate the value of plasma free DNA in the diagnosis of non-small cell lung cancer (NSCLC).MethodsPlasma was collected from 116 patients with non-small cell lung cancer admitted to respiratory department, and 120 healthy subjects from Medical examination center, Shanxi Provincial People′s Hospital. Plasma free DNA was extracted and detected by fluorescence quantitative polymerase chain reaction, PCR.ResultsThe plasma free DNA level of healthy people was (18.65±6.30) ng/ml, and the plasma free DNA level in patients with non-small cell lung cancer was (200.70±88.54) ng/ml, the difference was statistically significant(P<0.01). The plasma free DNA content of stage Ⅰ/Ⅱ non-small cell lung cancer was (172.75±72.87) ng/ml, and the plasma circulating DNA content in stage Ⅲ/Ⅳ non-small cell lung cancer was (221.88±93.86) ng/ml,(P<0.05). There was no significant correlation between sex, age, smoking status and histological type (P>0.05).ConclusionPlasma circulating DNA is a potentially valuable biomarker that may be an effective tool for early diagnosis and clinical staging of non-small cell lung cancer.

Non-small cell lung cancer; Plasma free DNA; Early diagnosis; Tumor marker

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.06.011

陜西省科技廳2013年科技惠民專項(2013K14-02-09)

710068 西安，陜西省人民醫院健康體檢中心

杜潔， Email: dujie123._@163.com

R563

A

2017-07-16)

王亞南)

杜潔，隋永杰，李紅艷，等. 血漿游離DNA在非小細胞肺癌診斷中的價值[J/CD]. 中華肺部疾病雜志(電子版)， 2017， 10(6)： 686-689.