重組蛋白Rv2346c抑制巨噬細胞對結核分枝桿菌的免疫滅活效應

姚靜 邵燕 杜興冉 馮旰珠

·論著·

重組蛋白Rv2346c抑制巨噬細胞對結核分枝桿菌的免疫滅活效應

姚靜1邵燕2杜興冉3馮旰珠1

目的探討重組蛋白Rv2346c對卡介苗 (BCG)感染鼠巨噬細胞(RAW264.7)后的免疫效應的影響及其機制。方法通過DNA合成、基因擴增、載體構建、誘導表達、純化等過程制備重組蛋白Rv2346c；利用Cell Counting Kit-8 (CCK8)方法檢測RAW264.7增殖水平；采用菌落形成試驗評估BCG生長情況；運用 ELISA方法檢測BCG和RAW264.7共培養上清中的腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、 白細胞介素-6 (IL)-6的濃度；采取Western blot方法檢測RAW264.7細胞中核轉錄因子κB(NF-κB)p65的表達水平。結果DNA測序及Western blot檢測證實成功制備重組蛋白Rv2346c；BCG可以抑制RAW264.7細胞增殖(P<0.05)，而RAW264.7細胞對BCG有滅活作用(P<0.05)；重組蛋白Rv2346c可以增強BCG對RAW264.7細胞增殖的抑制作用(P<0.05)，并降低RAW264.7對BCG的滅活效應(P<0.05)；Rv2346c還可以抑制 RAW264.7分泌TNF-α和IL-6(P<0.05)，并抑制NF-κB p65的表達(P<0.05)。結論重組蛋白Rv2346c可以抑制小鼠巨噬細胞RAW264.7對BCG的免疫滅活效應，該作用可能與抑制細胞因子分泌和NF-κB p65活化有關，具體機制值得進一步深入探討。

重組蛋白Rv2346c； 巨噬細胞； 結核分枝桿菌

結核病是全球范圍內高發病率和高致死率的傳染病，全球每年大約有960萬新發病例，約有150萬患者死亡[1-2]。盡管卡介苗(bacillus calmette-guerin, BCG)在預防結核病的應用已有80多年的歷史，但是其有效率至多達到80%，保護期僅10～15年，并且存在諸多不穩定因素[3]。因此，如何有效應對結核分枝桿菌感染、控制其蔓延與傳播成為當前十分重要的臨床問題。BCG是減毒的牛分枝桿菌，與結核分枝桿菌野生株相比，共丟失16個區域(region of difference 1～16, RDl～RDl6)的DNA片段。有文獻報道，結核分枝桿菌對巨噬細胞發揮免疫抑制作用可能與BCG丟失區域編碼的某些蛋白有關[4]。早期分泌靶抗原6 (early secreted antigenic target-6, ESAT-6)是結核分枝桿菌早期培養或感染階段產生的一系列低分子抗原，具有很強的特異性，只存在于致病的結核分枝桿菌野生型菌株中，而在BCG中則已丟失[5]。結核分枝桿菌RD7區Rv2346c基因編碼的分泌蛋白為ESAT-6家族成員，與其他ESAT-6家族蛋白具有超過90%的同源性，有研究表明，Rv2346c蛋白可能成為區分結核感染與疫苗免疫的標志物[6-7]。巨噬細胞是體內參與抗結核桿菌的重要細胞，結核分枝桿菌活化后的巨噬細胞可以分泌腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、 白介素-6(interleukin-6, IL-6)等細胞因子,這些細胞因子不僅可以促進巨噬細胞的吞噬-溶酶體免疫反應，還能對結核分枝桿菌發揮直接殺滅功能[8-9]。本實驗就重組蛋白Rv2346c對BCG感染鼠巨噬細胞后的免疫反應的影響進行了觀察研究，報道如下。

材料與方法

一、實驗材料

大腸埃希菌(E．Coli)感受態細胞BL21(DE3)購自Novagen公司；E3(pET-30a(+))載體購自Novagen公司；RAW264.7細胞購自美國ATCC公司；BCG 凍干粉由江蘇省疾病預防控制中心提供。T4DNA連接酶、DNA聚合酶和限制性內切酶NdeI-HindIII(NEB)等購自Thermo公司；PCR產物純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒和質粒抽提試劑盒均購自AXYGEN公司；蛋白質相對分子質量標準購自金斯瑞公司；相對分子質量3×103超濾濃縮管購自sartorius公司；Ni-IDA親和純化柱購自金斯瑞公司。細胞計數試劑盒8 (Cell Counting Kit-8, CCK8)試劑盒購自日本同仁公司；ELISA試劑盒購自R&D Systems公司；抗 His 單抗購自Sigma公司；抗核轉錄因子κB (nuclear transcription factor-kappa B, NF-κB) p65抗體、抗GAPDH抗體購自Abcam公司；辣根過氧化物酶 (horse radish peroxidase, HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗、HRP標記的山羊抗小鼠IgG二抗購自Bioworld公司。

二、實驗方法

1. Rv2346c的PCR引物的設計和合成: 根據GenScript密碼子優化網站得出的Rv2346c基因序列，Primer 5.0設計引物，上游引物序列：5′-AACTTTAAGAAGGAGATATA-3′；下游引物序列：5′-GCGGCCGCACTCGAGCAC-3′，由南京金斯瑞公司合成。

2. 目的基因擴增與載體構建: 根據GenScript密碼子優化網站得出的Rv2346c基因序列，由金斯瑞公司合成DNA模板。PCR擴增反應條件：94 ℃ 預變性5 min； 96 ℃變性25 s、58 ℃退火25 s、72 ℃延伸l min，共30個循環。PCR產物在加有0.5 μg/ml溴化乙啶(EB)的1.0%瓊脂糖凝膠上電泳后，紫外燈下觀察條帶，根據相對分子質量割膠后回收。用限制性內切酶NdeI-HindⅢ(NEB)酶切E3質粒和PCR產物后，T4DNA連接酶連接，轉化于BL21(DE3)感受態中，接種于含卡那霉素(50 μg/ml)的TB培養基上，37 ℃培養過夜，挑選陽性克隆進行測序鑒定。

3. 目的基因的誘導表達與純化: 將測序正確的質粒轉化于BL21(DE3)感受態中，涂布于含卡那霉素的固體平板上，37 ℃培養過夜。挑取單克隆接種于含卡那霉素的TB培養基中，37 ℃震蕩培養至波長600 nm處的吸光度為0.6時，保菌種后加入β-硫代半乳糖苷至終濃度為1.0 mmol/L，37 ℃振蕩培養4 h，以離心半徑8 cm，8 000 r/min，4 ℃離心10 min。加入破碎緩沖液重懸菌體，超聲波破碎(300 w，間歇6 s，工作3 s，共計15 min)后，以離心半徑8 cm，13 000 r/min，4 ℃離心30 min，收取上清。用Ni-IDA柱進行親和純化，收集洗脫組分。4%～12.0%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，合并目標蛋白峰，用截留量為相對分子質量3×103的超濾管以離心半徑8 cm，5 000 r/min，4 ℃離心進行濃縮。Bradford法測定蛋白濃度后，用0.22 μm的除菌膜過濾除菌，分裝后-80 ℃保存蛋白。

將純化的Rv2346c重組蛋白進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍R-250染色，于Tanon凝膠成像儀下拍照，獲取圖片，圖像分析軟件通過灰度分析估計純度。利用Western blot方法檢測純化的 Rv2346c重組蛋白。將純化的重組蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉膜，含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液(Tris緩沖鹽溶液，含20 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、0.1% v/v Tween-20，pH 7.4)室溫下封閉1 h。然后用含5% BSA的TBST按照1︰1000稀釋的一抗(抗His抗體)于4 ℃孵育過夜，TBST在室溫下洗3次；再用含5% BSA的TBST按照1︰5 000稀釋的二抗(HRP標記的山羊抗小鼠IgG二抗)室溫下孵育2 h，然后用TBST在室溫下洗3次。最后采用ECL進行化學發光，于Tanon凝膠成像儀下拍照，獲取圖片,條帶灰度值利用Image J 軟件進行分析。

4. BCG和Rv2346c重組蛋白干預影響RAW264.7細胞增殖: RAW264.7細胞在37 ℃，5% CO2的條件下進行培養，培養基為含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素及2 mmol/L谷氨酰胺的DMEM。BCG疫苗用專用稀釋液稀釋后接種于羅氏培養基斜面上，37 ℃培養21 d后，取羅氏培養基上生長良好的BCG于勻漿器中，加少量含0.05% Tween-80的生理鹽水研磨均勻，以不含抗生素的DMEM培養液(含10%胎牛血清)稀釋成菌懸液，采用麥氏比濁法，調整細菌濃度為 1.0×107/ml。

將處于對數生長期的細胞以無抗DMEM培養液(含10%胎牛血清)重懸后，按照細胞密度為5 000個/孔鋪于96孔板中，培養箱內孵育過夜。然后對照組加入相應劑量培養液以代替細菌懸液，BCG組按照感染復數(multiplicity of infection, MOI)依次為1︰1,1︰5,1︰10,1︰50加入BCG，BCG+Rv2346c組加入BCG(MOI為1︰5)及Rv2346c重組蛋白(孔內終濃度依次為50, 100, 500, 1 000 pg/ml)，利用培養液調整每孔總體積至100 μl。培養箱內分別孵育24、48、72 h，在相應培養時間結束后加入無血清培養基及10 μl CCK8試劑繼續培養2 h，放入酶標儀490 nm波長檢測OD值。

5. BCG菌落形成試驗: 按上述條件培養的RAW264.7細胞按照1×105個/孔接種于24孔細胞培養板中，培養過夜。對照組加入相應劑量培養液代替細菌懸液；BCG組加入BCG(MOI為1︰5)；BCG+Rv2346c組加入BCG(MOI為1︰5)及Rv2346c重組蛋白(孔內終濃度為500 pg/ml)。在每孔加無抗DMEM培養液調整每孔體積至500 μl，分別繼續培養24 h、48 h和72 h。培養結束后用預溫的不含血清的DMEM培養液洗滌細胞培養板2次，每孔加入250 μl 1% Triton X-100裂解巨噬細胞。倒置顯微鏡下觀察巨噬細胞的裂解情況，待巨噬細胞全部裂解后每孔加入250 μl完全DMEM培養液(含10%胎牛血清)終止裂解。混勻后每孔分別做1︰10稀釋，取100 μl接種羅氏培養基，37 ℃恒溫培養箱培養28 d后進行菌落計數。

6. ELISA檢測細胞因子: RAW264.7細胞以1×105個/孔接種于24孔細胞培養板中，培養過夜。然后對照組加入相應劑量培養液以代替細菌懸液，BCG組加入BCG(MOI為1︰5)，BCG+Rv2346c組加入BCG(MOI為1︰5)及Rv2346c重組蛋白(孔內濃度500 pg/ml)，利用無抗DMEM培養液調整每孔總體積至500 μl。分別收集感染孵育24、48、72 h后的培養上清，按照試劑盒說明操作，對上清中TNF-α、IL-6進行檢測，根據吸光度值計算其含量。

7. Western blot檢測蛋白表達: RAW264.7細胞以2×106個/孔接種于6孔細胞培養板中，培養過夜。然后對照組加入相應劑量培養液以代替細菌懸液，BCG組加入BCG(MOI為1︰5)，BCG+Rv2346c組加入BCG(MOI為1︰5)及Rv2346c重組蛋白(孔內濃度500 pg/ml)，利用無抗DMEM培養液調整每孔總體積至2 ml。分別收集感染孵育24、48、72 h后的細胞，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，以離心半徑8 cm，4 ℃下12 000 r/min離心5 min。Bradford法測定上清蛋白含量。將提取蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉膜，5%脫脂奶粉TBST溶液室溫下封閉1 h。然后用含5% BSA的TBST按照1︰1 000稀釋的一抗(抗NF-κB p65抗體、抗GAPDH抗體)于4 ℃孵育過夜，TBST在室溫下洗3次；再用含5% BSA的TBST按照1︰5 000稀釋的二抗(HRP標記的山羊抗兔IgG二抗、HRP標記的山羊抗小鼠IgG二抗)室溫下孵育2 h，然后用TBST在室溫洗3次。最后采用ECL進行化學發光，于Tanon凝膠成像儀下拍照，獲取圖片，條帶灰度值利用Image J軟件進行分析。

三、統計學方法

結 果

一、擴增基因Rv2346c并構建重組質粒的鑒定

經基因擴增、酶切、連接、轉化表達菌體，挑選陽性克隆進行測序鑒定。測序結果表明，與預期序列100%匹配，提示重組質粒構建成功，測序結果，見圖1。

圖1 重組表達的Rv2346c基因測序結果

二、重組質粒的誘導表達

重組質粒pET-30a-Rv2346c轉化大腸埃希菌，經誘導表達及親和純化后，純化后的蛋白SDS-PAGE結果顯示在相對分子量約12 kDa處可見明顯的目的蛋白條帶，與預期的蛋白分子相對分子質量(12×103)相符，測得純化的重組蛋白濃度為2.5 mg/ml，圖像軟件分析表明純化后其純度為90%，見圖2。

圖2 SDS-PAGE分析；注：泳道1: BSA (2.00 μg)，泳道2: 重組蛋白Rv2346c (1.65 μg)；箭頭指示重組蛋白Rv2346c條帶

三、Western Blot鑒定

純化的Rv2346c重組蛋白(含His標簽)與抗His抗體反應后，在相對分子質量約為12×103處出現1條與預期大小一致的特異性條帶，見圖3。

圖3 Western Blot分析；注：泳道 3: 重組蛋白Rv2346c；箭頭指示重組蛋白Rv2346c條帶

四、Rv2346c聯合BCG抑制RAW264.7增殖

利用CCK-8試驗研究重組蛋白Rv2346c和BCG對RAW264.7增殖的影響。如圖4所示，BCG分別按照MOI依次為1︰1,1︰5,1︰10,1︰50感染細胞后，在24、48、72 h三個培養時間下，隨著BCG濃度的增加，對細胞增殖的抑制越明顯。結合既往文獻報道[10]，我們選擇在MOI為1︰5條件下，利用不同濃度重組蛋白Rv2346c進行干預，結果顯示，隨著Rv2346c的濃度增加，對細胞增殖的抑制作用逐漸增強，且培養時間越長，表現出抑制作用的Rv2346c的濃度越低，見圖5。

五、Rv2346c減輕RAW264.7對BCG的滅活作用

如表1及圖6所示，隨著BCG與RAW264.7共培養的時間延長，菌落形成的數量減少，各組之間差別有統計學意義(P<0.05)，結果提示RAW264.7對BCG存在抑制作用；在BCG與RAW264.7共培養過程中加入重組蛋白Rv2346c后，在各個作用時間下，BCG+Rv2346c組菌落數量均較BCG組增加，差別有統計學意義(P<0.05)，該結果表明Rv2346c可以減少RAW264.7對BCG的抑制作用。

圖4 BCG對RAW264.7增殖的影響；注：*與對照組相比，P<0.05；#直線兩端之間兩組比較，P<0.05

圖5 BCG和Rv2346c共同作用對RAW264.7增殖的影響；注：*P<0.05，與相同培養時間下的對照組相比；#P<0.05，與相同培養時間下的BCG + Rv2346c (50 pg/ml)組相比；+，P<0.05, 與相同培養時間下的BCG+Rv2346c (100 pg/ml)組相比；§P<0.05，與相同培養時間下的BCG + Rv2346c (500 pg/ml)組相比

表1 Rv2346c影響巨噬細胞對BCG的免疫抑制作用

注：aP<0.05，與相同培養時間下的BCG組相比；bP<0.05，相同干預條件下，與培養24 h組相比；cP<0.05，相同干預條件下，與培養48 h組相比

圖6 Rv2346c影響BCG與巨噬細胞共培養后形成的菌落數量

六、Rv2346c抑制RAW264.7分泌TNF-α和IL-6

研究結果表明，與對照組相比，BCG可以誘導RAW264.7分泌TNF-α和IL-6明顯增加，差別有統計學意義(P<0.05)；且隨BCG和RAW264.7共培養時間延長，RAW264.7分泌的TNF-α、IL-6增多，并且具有統計學差異(P<0.05)；但是在各個培養時間下，與單純BCG感染組相比，Rv2346c可以明顯抑制BCG誘導的TNF-α和IL-6分泌增加(P<0.05)，見表2。

七、Rv2346c影響RAW264.7中NF-κB p65的表達

利用Western Blot檢測RAW264.7中NF-κB p65的蛋白表達水平，結果顯示，與對照在相比，BCG抑制細胞中NF-κB p65的表達，差別有統計學意義(P<0.05)；隨干預時間延長，抑制作用增強(P<0.05)，與單純BCG感染組相比，Rv2346c能進一步增強BCG對NF-κB p65表達的抑制作用(P<0.05) 見表3，圖7。

表2 BCG與RAW264.7共培養上清中TNF-α和IL-6水平

注：aP<0.05，與對照組相比；bP<0.05，相同干預時間下，BCG+Rv2346c組與BCG組相比；cP<0.05，相同干預條件下，與干預24 h組相比；dP<0.05，相同干預條件下，與干預48 h組相比

圖7 RAW264.7中NF-κB p65的表達

表3 BCG與RAW264.7共培養后細胞內NF-κB蛋白表達水平

注：aP<0.05，與對照組相比；bP<0.05，相同干預時間下，BCG+Rv2346c組與BCG組相比；cP<0.05，相同干預條件下，與干預24 h組相比；dP<0.05，相同干預條件下，與干預48 h組相比

討 論

BCG作為結核疫苗保留了結核分枝桿菌的免疫原性，而降低了致病性，這與BCG丟失了部分毒性蛋白的編碼基因有關，本實驗選取缺失基因編碼的蛋白Rv2346c，研究其是否影響巨噬細胞對BCG的殺滅作用，進而對其在結核分枝桿菌毒力中的作用進行評價。我們首先表達純化了重組蛋白Rv2346c，并進行測序驗證，然后利用重組蛋白Rv2346c對BCG感染RAW264.7的過程進行干預。研究發現，Rv2346c可以促進BCG抑制RAW264.7增殖的作用，也可以減輕RAW264.7對BCG的殺傷作用，該結果表明Rv2346c增強了BCG抵抗巨噬細胞的免疫抑制作用,因而Rv2346c可能在結核分枝桿菌致病性中發揮重要作用。

結核分枝桿菌是一種細胞內寄生菌，感染機體后在與機體固有免疫系統作用的過程中，首先被巨噬細胞通過病原模式識別受體結合，繼之啟動吞噬-溶酶體酸化滅活、caspase途徑誘導細胞凋亡等應答反應，最終引起對結核桿菌的殺滅[11]。巨噬細胞在免疫過程中通過產生多種細胞因子直接或間接對結核桿菌發揮殺傷作用。已有研究表明，巨噬細胞產生TNF-α能夠促進IL-6的分泌，還能誘導活性氧的產生，產生直接殺菌效應，TNF-α缺失可影響巨噬細胞對結核分枝桿菌的免疫殺傷，且固化結核分枝桿菌的肉芽腫也不能形成；同樣在IL-6缺乏的狀況下，也會導致其誘導免疫應答的弱化，從而使感染宿主組織中的結核分枝桿菌負荷增加[12]。因而，TNF-α、IL-6等細胞因子的合成與分泌對巨噬細胞抵抗結核分枝桿菌至關重要，甚至影響感染后整體狀況的轉歸[13-14]。本實驗研究發現，在BCG感染RAW264.7后，巨噬細胞分泌TNF-α、IL-6明顯增多，而重組蛋白Rv2346c干預后能夠抑制RAW264.7產生TNF-α、IL-6，該結果表明Rv2346c可能通過抑制細胞因子的產生對巨噬細胞的抑菌作用產生影響。核轉錄因子NF-κB通過誘導細胞內TNF-α等細胞因子的分泌來實現在結核分枝桿菌感染后宿主免疫細胞應答中的調控作用[15-21]。NF-κB被激活后與相應的調控靶基因上的κB特異序列位點結合，可啟動或增強相應基因的轉錄(如TNF-α、IL-1和IL-6等細胞因子)，而這些轉錄產物中的TNF-α及IL-6也可再激活NF-κB，形成正反饋調節，進一步增強其調控的基因表達，因而NF-κB是控制結核分枝桿菌感染的關鍵分子[16]。為了探究介導Rv2346c對巨噬細胞發揮免疫抑制效應的相關信號分子，我們對NF-κB p65活化水平進行了檢測。本研究顯示Rv2346c干預后可以進一步促進BCG對NF-κB蛋白表達的抑制作用，因而，NF-κB可能是Rv2346c發揮免疫抑制作用的關鍵靶點。

綜上所述，本研究發現重組蛋白Rv2346c可以減少鼠巨噬細胞RAW264.7對BCG的免疫滅活，其作用可能與抑制巨噬細胞細胞因子的分泌及NF-κB p65的表達有關，但是其作用的具體機制尚需進一步深入探究。本實驗通過對結核分枝桿菌RD7區Rv2346c基因編碼蛋白的研究，為闡明結核分枝桿菌在體內的免疫逃避機制提供了新的研究思路。

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RecombinantproteinRv2346cinhibitstheimmunologicalresponseofmacrophageagainstMycobacteriumtuberculosis

YaoJing1,ShaoYan2,DuXingran3,FengGanzhu1.

1Departmentofrespiration,thesecondaffiliatedhospitalofNanjingmedicaluniversity,Nanjing210011,China;2Jiangsuprovincialcenterfordiseasepreventionandcontrol,Nanjing210009,China;3Departmentofinfectiousdisease,thesecondaffiliatedhospitalofNanjingmedicaluniversity,Nanjing210011,China

FengGanzhu,Email:zhu1635253@163.com

ObjectiveTo investigate the effect of recombinant protein Rv2346c on murine macrophage-induced immunological response on Bacillus Calmette-Guerin (BCG) and the molecular mechanism related.MethodsDNA synthesis, gene amplification, vector construction, induced expression and protein purification were used to synthesize recombinant protein Rv2346c. Cell Counting Kit-8 (CCK8) kit was applied to tested the proliferation of RAW264.7. Colony formation unit was observed to estimate the growth of BCG. Enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA) was utilized to detect tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin (IL)-6 in co-culture supernatant. Western blot was conducted to measure the expression of NF-κB (nuclear transcription factor-kappa B) p65. T test was applied to compare the means of two independent groups andP<0.05 was considered statistically significant.ResultsRecombinant protein Rv2346c was verified by DNA sequencing and Western blot. BCG inhibited the proliferation of RAW264.7 (P<0.05 ) while RAW264.7 inactivated BCG (P<0.05 ). Recombinant protein Rv2346c enhanced the BCG-induced inhibition on the proliferation of RAW264.7 (P<0.05 ) and reduced RAW264.7-medicated immunological killing effect against BGG (P<0.05 ). Rv2346c also suppressed the secretion of TNF-α and IL-6 by RAW264.7 (P<0.05 )and accelerated the protein expression of NF-κB p65 (P<0.05 ).ConclusionRecombinant protein Rv2346c could reduce macrophage-medicated immunological killing effect on BCG, which could be associated with the reduced secretion of cytokines and the suppression of NF-κB p65 expression. The exact mechanisms remain to be further explored.

Recombinant protein Rv2346c; Macrophage;Mycobacteriumtuberculosis

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.06.005

國家自然科學基金資助項目(81470209)

210011 南京，南京醫科大學第二附屬醫院呼吸科1、感染科3

210009 江蘇省疾病預防控制中心2

馮旰珠， Email: zhu1635253@163.com

R563

A

2017-07-26)

張大春)

姚靜，邵燕，杜興冉，等. 重組蛋白Rv2346c抑制巨噬細胞對結核分枝桿菌的免疫滅活效應[J/CD]. 中華肺部疾病雜志(電子版)， 2017， 10(6)： 655-661.