氯化銫密度梯度離心法提純棗瘋病植原體DNA

劉玲雪+肖琦+楊淑珂+路興波+高瑞

摘要：本研究利用CTAB法提取感染棗瘋病的棗樹葉片總DNA，再通過氯化銫-雙苯酰亞胺密度梯度離心從總DNA中富集純化棗瘋病植原體DNA。利用棗樹26S rDNA基因和棗瘋病植原體16S rDNA基因的特異引物，分別對富集純化前后感病棗樹葉片總DNA進行PCR擴增。結果表明，模板濃度為1 ng/μL時，富集后的總DNA模板擴增棗樹26S rDNA的電泳條帶亮度低于富集前，擴增棗瘋病植原體16S rDNA電泳條帶亮度明顯高于富集前。Real-time PCR檢測結果表明，模板濃度為1 ng/μL時，純化后的棗瘋病植原體DNA中26S rDNA相對純化前的量為0.0638，而JWB相對純化前的量為0.5035，這說明采用氯化銫-雙苯酰亞胺密度梯度離心法可以有效地從感染棗瘋病棗樹總DNA中富集純化棗瘋病植原體DNA。

關鍵詞：棗瘋病；植原體；CTAB法；氯化銫-雙苯酰亞胺密度梯度離心

中圖分類號：S763.1：S665.1文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2017）11-0134-04

Separation and Purification of Phytoplasma Genomic DNA

of Jujube Witches Broom by Cesium Chloride Density

Gradient Centrifugation

Liu Lingxue， Xiao Qi， Yang Shuke， Lu Xingbo， Gao Rui

（Institute of Plant Protection， Shandong Academy of Agricultural Sciences/

Shandong Provincial Key Laboratory of Plant Virology， Jinan 250100， China）

AbstractThe total DNA was extracted from infected jujube leaves using CTAB method and then the genomic DNA of jujube witches broom（JWB） phytoplasma was separated and purified from the total DNA by cesium chloride-bisbezimide density gradient centrifugation method. The specific primers aimed to 26S rDNA of jujube and 16S rDNA of JWB phytoplasma were designed to conducted PCR amplification with infected jujube total DNA before and after purification as template respectively. Our findings suggested that when the concentration of template DNA was 1 ng/μL， the electrophoretic band brightness of 26S rDNA of purified phytoplasma DNA was lower than that of total DNA， but the electrophoretic band brightness of JWB was brighter. Moreover， the results of real-time PCR showed that when the concentration of template DNA was 1 ng/μL， the amount of 26S rDNA in the purified phytoplasma DNA relative to that in total DNA was 0.0638， while the amount of JWB relative to that in total DNA was 0.5035. It suggested that the phytoplasma DNA could be effectively isolated and purified from infected jujube total DNA by the method of cesium chloride-bisbezimide density gradient centrifugation.

KeywordsJujube witches broom； Phytoplasma； CTAB method； Cesium chloride-bisbezimide density gradient centrifugation

植原體（phytoplasma）是一類無細胞壁、不能人工培養、存在于植物篩管細胞內的病原細菌。世界各地已報道的植原體可引起1 000余種植物的系統性病害，涵蓋農作物、園藝、花卉、果樹和林木等。我國也已報道了100多種植物上發生與植原體相關的病害[1]。棗瘋病（jujube witchesbroom disease）是我國棗樹最嚴重的病害，也是世界典型的植原體病害之一，其病原為棗瘋植原體（jujube witchesbroom phytoplasma），屬于榆樹黃化16SrV-B亞組[2]。棗樹感病后結果量減少，品質下降，通常2～3年內病樹喪失產量并全株死亡。棗瘋病幾乎分布于國內主要棗樹栽培區，每年造成死樹高達千萬株，直接經濟損失達數億元，已嚴重阻礙我國棗樹產業的可持續發展[3]。由于植原體不能分離培養，難以得到高純度的植原體基因組DNA，因此，目前僅有少數植原體分離物完成了全基因組測序，并且各個種之間基因組結構變化較大，這為在分子水平上闡明棗瘋病植原體及其他植原體的致病機制及進行病害防治等帶來了難以克服的困難[4]。

氯化銫密度梯度離心是分離和純化DNA常用的方法之一，純化的DNA可用于文庫構建、基因組測序及核酸雜交等研究。氯化銫在一定的離心時間和離心力下會形成線性的密度梯度，而不同GC含量的DNA會聚集在不同位置，由此可以將DNA中的不同組分在空間上進行分離。雙苯酰亞胺可以與DNA中富含AT的序列結合，在紫外燈下可以觀察到藍色的熒光，便于DNA條帶的觀察和收集[5]。植原體DNA中AT含量高達72.6%～78.6%，而GC含量僅為21.4%～27.4%，因此可以利用氯化銫-雙苯酰亞胺密度梯度離心法通過多輪離心分離目的條帶，達到分離純化DNA的目的。本研究擬通過氯化銫-雙苯酰亞胺密度梯度離心法從感病棗樹總DNA中富集純化棗瘋病植原體DNA，并利用熒光定量PCR分析分離效果，以期為進一步實施棗瘋病植原體的基因組測序奠定基礎。

1材料與方法

1.1供試材料

取棗樹的健康植株和帶有棗瘋病癥狀的植株樣本，分成小份用錫箔紙包裹后放在液氮中快速冷凍，于-80℃冰箱中保存備用。

1.2棗樹及植原體總DNA的提取

總DNA的提取方法參考Porebsk的CTAB法[6]。稱取0.2 g棗樹葉片，在液氮中充分研磨成粉末后裝入離心管中，加入1 mL 65℃預熱的CTAB提取緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl，1.4 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，2% CTAB，1% PVP，1% β-巰基乙醇），混勻，65℃保溫2 h（期間不時輕緩顛倒混勻），加入1 mL氯仿∶異戊醇（24∶1），輕緩顛倒混勻溶液，13 000 r/min離心20 min至分相，將上清轉移到干凈的離心管中，再次加入1 mL氯仿∶異戊醇（24∶1），輕緩顛倒混勻溶液，13 000 r/min離心20 min，將上清轉移到干凈的離心管中，加入1 mL異丙醇，放入-20℃冰箱冷凍30 min，13 000 r/min離心20 min，棄上清，加入1 mL 70%乙醇，13 000 r/min離心1 min，棄上清，再加入1 mL 70%乙醇洗滌沉淀，13 000 r/min離心1 min，除去殘留的乙醇，待沉淀干燥。

1.3棗樹及植原體DNA-CsCl溶液的制備

將DNA沉淀小心溶解于適量的 CsCl溶液（1.4 g/mL CsCl，10 mmol/L Tris-HCl，pH=8.0）中，將DNA-CsCl∶雙苯酰亞胺=2∶1溫和混勻，避光過夜，用數字阿貝折射儀（WAY-2S，上海儀電物理光學儀器有限公司）調節溶液的折射率[5]。

1.4棗瘋病植原體DNA的富集

利用Beckman Optima MAX-XP臺式超速離心機，MLA-55轉頭，20℃、52 000 r/min下離心48 h，小心取出離心管，置于UV 365 nm下拍照觀察。用注射器吸取離心管中的目的條帶至50 mL離心管中，紫外分光光度法測量DNA濃度，再次按DNA-CsCl∶雙苯酰亞胺=2∶1染色，用數字阿貝折射儀調節溶液的折射率，20℃、52 000 r/min下離心48 h，小心取出離心管，置于UV 365 nm下再次觀察收集。

1.5棗瘋病植原體DNA的純化

向吸取的植原體DNA溶液組分中加入等體積的異丙醇，緩慢顛倒幾次，分層后小心去掉上層溶液，重復這一過程直到將離心管暴露于紫外燈下觀察不到熒光。加2.5倍體積的80%乙醇，室溫下16 060×g離心20 min，沉淀植原體DNA，棄上清液，70%乙醇洗滌并干燥兩次，用適量的水溶解，紫外分光光度法測量DNA濃度[7]。

1.6分離純化效果分析

以棗瘋病植原體的16S rDNA序列為模板設計用于擴增棗瘋病植原體DNA的PCR引物[8]，以棗樹的26S rDNA序列為模板設計用于擴增棗樹DNA的PCR引物，如表1所示。將富集純化前后感病棗樹總DNA濃度稀釋為10、1 ng/μL和100、10、1、0.5、0.25、0.125 pg/μL，以其為模板進行PCR擴增。PCR程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55～59℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環；72℃再延伸10 min。

2結果與分析

2.1超速離心法分離純化棗瘋病植原體DNA

采用CTAB法提取健康棗樹和感染棗瘋病棗樹葉片總DNA，將提取的DNA與CsCl、雙苯酰亞胺溶液混勻，20℃、52 000 r/min離心48 h后，置于UV 365 nm下拍照觀察。如圖1所示，健康植株離心管中只有一條熒光條帶，而棗瘋病植株離心管中有兩條熒光條帶，一條與健康植株DNA條帶位置相同，另一條約在健康植株DNA條帶上方1 cm處，位于上方的條帶即為棗瘋病植原體DNA。

用注射器小心地吸取棗瘋病植株離心管上方的棗瘋病植原體DNA條帶至50 mL離心管中，紫外分光光度法測量DNA濃度后，再次按DNA-CsCl∶雙苯酰亞胺=2∶1染色，用數字阿貝折射儀調節溶液的折射率，20℃、52 000 r/min離心48 h，置于UV 365 nm下再次觀察收集。如圖1所示，棗瘋病植株離心管中只有一條熒光條帶，位置約在健康植株DNA條帶上方1 cm處，這表明棗瘋病植原體DNA條帶位置較穩定，且收集到的棗瘋病植原體DNA溶液中已很少有寄主植株的DNA存在。利用紫外分光光度計測定富集純化后感病棗樹總DNA濃度為203 ng/μL。

.2分離純化效果分析

分別以富集純化前后感病棗樹總DNA為模板，利用引物對JWB-F/JWB-R和26S rDNA-F/26S rDNA-R進行PCR擴增，結果如圖2所示，模板濃度為10 ng/μL時，兩種DNA模板的26S rDNA的電泳條帶亮度基本一致，但純化后的棗瘋病植原體總DNA的JWB電泳條帶亮度明顯高于純化前。模板濃度為1 ng/μL時，純化后的棗瘋病植原體總DNA模板的26S rDNA的電泳條帶亮度低于純化前，但純化后的棗瘋病植原體總DNA的JWB電泳條帶亮度仍明顯高于純化前，這表明通過氯化銫-雙苯酰亞胺密度梯度離心法分離純化后的棗瘋病植原體總DNA中寄主植株的DNA含量明顯減少。

M：天根DNA Marker Ⅰ；1～3：模板濃度10 ng/μL下的16S rDNA條帶；1：未純化DNA；2：純化后DNA；3：陰性對照；4～6：模板濃度10 ng/μL下的26S rDNA條帶；4：未純化DNA；5：純化后DNA；6：陰性對照；7～9：模板濃度1 ng/μL下的16S rDNA條帶；7：未純化DNA；8：純化后DNA；9：陰性對照；10～12：模板濃度1 ng/μL下的26S rDNA條帶； 10：未純

為了進一步定量分析超速離心純化效果，分別以不同稀釋度的富集純化前后感病棗樹總DNA為模板進行Real-time PCR，結果如表2所示，當模板濃度為1 ng/μL時，純化后的棗瘋病植原體總DNA中26S rDNA相對純化前的量為0.0638，而JWB相對純化前的量為0.5035。該結果表明，采用氯化銫-雙苯酰亞胺密度梯度離心法可以有效地從感染棗瘋病的棗樹總DNA中分離純化棗瘋病植原體DNA。

3討論與結論

棗樹是我國一種重要的經濟作物。由于棗瘋病的毀滅性威脅，導致棗產量遭受巨大損失，20世紀70—80年代，河北玉田和北京密云等地的金絲小棗曾絕產絕收[9]。因此，進一步了解和防治棗瘋病已迫在眉睫，而植原體全基因組測序研究對認識和防治此類病害具有重要意義。

本研究采用氯化銫-雙苯酰亞胺密度梯度超速離心法分離純化植原體的基因組DNA，該方法簡便易行，是目前應用較多的一種方法[5，10]。不同氯化銫初始密度對DNA的分離效果具有非常明顯的影響，條帶位置隨氯化銫初始密度大小的變化而改變，密度越大，條帶位置越靠近離心管口。當氯化銫初始密度過低時，植原體與植物基因組DNA聚集在離心管底部，不能達到分離的效果。陳昱圻等[8]報道氯化銫初始密度為1.5622 g/cm3，折射率為1.3871時分離效果最佳，而本試驗中達到最佳分離效果的折射率為1.3942，這可能與超速離心時的轉速、離心管的型號等多種因素不同有關。此外，DNA終濃度不同也會引起不同的分離效果，Tran-Nguyen等[5]研究表明，DNA終濃度最好不要超過100～150 μg/mL，DNA終濃度過高會使寄主植物的DNA條帶較寬，甚至完全覆蓋植原體DNA的條帶，導致不能使植原體DNA從寄主植物基因組DNA中分離出來。本試驗通過對一系列不同DNA終濃度的探索發現，在DNA終濃度為120 μg/mL時分離效果最佳，這與Tran-Nguyen等研究結果一致。

本研究結合Real-time PCR對氯化銫-雙苯酰亞胺密度梯度超速離心法的分離純化效果進行評估，結果表明該方法可以有效地從感染棗瘋病的棗樹DNA中分離純化出棗瘋病植原體DNA，這為制備高純度的植原體DNA和棗瘋病植原體全基因組測序提供了方法參考。

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收稿日期：2017-09-12

基金項目：山東省重點研發計劃項目（2015GNC110026）；山東省農業科學院青年基金項目“雙孢菇多肽的制備及其生物活性研究”

作者簡介：弓志青（1976—），女，博士，副研究員，從事果蔬加工研究。E-mail：gongzq413@tom.con

通訊作者：王文亮（1980—），男，碩士，副研究員，從事食用菌加工研究。E-mail：cywwl@163.com