26個香菇菌株的遺傳多樣性分析

任海霞+宮志遠+蔣志琴+陸玉榮+任鵬飛+萬魯長

摘要：香菇（Lentinus edodes）是世界上著名的食用菌之一，其菌株種類較多，遺傳背景較為復雜。本研究利用ISSR-PCR技術，對26個香菇菌株進行DNA指紋分析，并使用NTSYS-PC軟件對其遺傳差異性進行聚類分析。結果表明，從106個隨機引物中共篩選到9個引物，利用這9個引物對26個香菇菌株的DNA進行ISSR-PCR，檢測到124個較為清晰的擴增位點，其擴增片段DNA分子量大小主要介于0.2～4.5 kb之間。通過聚類分析，發現相似水平在55%時出現種系分離；相似水平65%時，26個菌株聚為5個群組。本研究為山東省香菇遺傳信息庫的建立和遺傳育種工作奠定了一定的基礎。

關鍵詞：香菇；ISSR-PCR；聚類分析；遺傳多樣性

中圖分類號：S646.1+20.1文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2017）11-0020-05

Analysis of Genetic Diversity of 26 Lentinus edodes strains

Ren Haixia1， Gong Zhiyuan1， Jiang Zhiqin2， Lu Yurong2， Ren Pengfei1， Wan Luzhang1

（1.Institute of Agriculture Resources and Environment， Shandong Academy of Agricultural Sciences/

Key Laboratory of Wastes Matrix Utilization， Ministry of Agriculture， Jinan 250100，China；

2. Bazhou Science and Technology Development Exchange Center of Xinjiang， Bazhou 841000，China）

AbstractLentinus edodes is one of the most famous edible fungus species in the world. It has various strains and complex genetic background. In this study， we conducted DNA fingerprinting of 26 familiar Lentinus edodes strains by ISSR-PCR， and analyzed their genetic diversity by cluster analysis of NTSYS-PC software. The results showed that， 9 primers were selected from 106 random primers， which were used to conduct DNA ISSR-PCR in 26 Lentinus edodes strains， and 124 relatively clear sites were amplified with the DNA molecular weight ranging from 0.2 kb to 4.5 kb. Cluster analysis results showed that， species separation was appeared at the similarity level of 55%， and the 26 strains were mainly divided into five groups at the similarity level of 65%. This study laid certain foundations for establishing the genetic information library and genetic breeding of Lentinus edodes in Shandong Province.

KeywordsLentinus edodes；ISSR-PCR；Cluster analysis；Genetic diversity

香菇（Lentinus edodes）屬于真菌門，擔子菌綱，傘蘑目，皮傘科，富含蛋白質、多種人體必需氨基酸、糖類、礦物質、維生素和脂類等營養物質，同時含有香菇多糖、香菇嘌呤、雙鏈核糖核酸等免疫活性物質，具有極高的營養價值[1，2]。香菇是世界上第二大食用菌栽培菌種，其產量僅次于雙孢菇。中國香菇栽培生產發展迅速，近年來在香菇的產銷量上一直位居世界第一位[3]。隨著產銷量的增長，國內外對其栽培、育種、保鮮加工等方面高度重視，而香菇菌種是香菇生產中最重要的基礎，因此，引進和選育優質、高產、抗逆性強的菌株有助于香菇產業的快速發展[4]。但是目前我國香菇引種比較混亂，菌株同名異物和同物異名現象頻發，故對香菇菌株進行鑒定并確立其DNA指紋圖譜將有助于從分子生物學角度準確識別菌種、了解其親緣關系，從而有效利用不同香菇品種的優勢進行育種，促進生產的發展[5]。

ISSR（inter-simple sequence repeat，簡單序列重復區間擴增多態性）技術是在SSR和PCR基礎上發展起來的一項技術，由Zietkiewicz等于1994年首次在植物研究中使用[6] ，由于操作簡單、成本低、快速、靈敏、檢測多態性能力強等特點而倍受青睞[7]。近幾年該技術已逐步開始在食用菌種質資源研究、菌株鑒別和菌株遺傳多樣性分析等方面進行應用[8，9]。本研究采用ISSR-PCR方法，從106個隨機引物中篩選出9個引物，對本實驗室保存的26個香菇菌株進行遺傳多樣性分析，構建遺傳相關聚類圖，明確26個香菇菌株之間的親緣關系，以便為香菇育種積累基礎數據。endprint

1材料與方法

1.1供試菌株

本試驗所用的26個香菇菌株均由山東省農業科學院農業資源與環境研究所提供。各供試菌株的編號、名稱、特征及來源見表1。

1.2培養基

PDA固體培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O 1 g，蛋白胨3 g，酵母浸粉2 g，瓊脂21 g，加水定容至1 000 mL，121℃滅菌30 min。

液體培養基：葡萄糖40 g，蛋白胨4 g，KH2PO4 3 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，水1 000 mL，pH值7.0，121℃滅菌30 min。

1.3引物與試劑

試驗所用引物序列來自UBC Primer Set #9（Microsatellite），均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。DNA Marker、dNTPs、Taq酶以及EB等其它試劑均為天根生化科技有限公司產品，皆為分析純。

1.4香菇菌絲體培養及收集

挑取保藏香菇菌種接種于PDA斜面培養基上，25℃活化培養7～10天，再轉接到液體培養基中，在25℃、150 r/min恒溫搖床上培養12天。將培養液以3 000 r/min離心，棄上清液，用無菌蒸餾水洗滌菌絲3次，濾紙吸干殘余水分，將所得菌絲體在-20℃保存備用。

1.5香菇菌絲DNA的提取

DNA提取采用改進的SDS法[10]。

1.6ISSR-PCR反應

反應體系為20 μL，其中含有1×PCR Buffer，1.2 mmol/L Mg2+，0.6 μmol/L引物，200 μmol/L dNTPs，模板DNA 50 ng，0.06 U/μL Taq 酶。

ISSR-PCR反應程序為94℃預變性3 min；94℃變性45 s，50℃退火50 s，72℃延伸2 min，35個循環；最后72℃延伸7 min，停止反應。4℃保存反應液備用。

1.7ISSR-PCR產物電泳檢測

用1×TAE緩沖液配制濃度為1.2%的瓊脂糖溶液，ISSR-PCR反應結束后，PCR管中各加4 μL溴酚藍上樣緩沖液，取13～15 μL至上樣孔，以4～5 V/cm進行電泳。電泳結束后，用5 mg/mL EB溶液對瓊脂糖凝膠染色20 min，再用去離子水脫色漂洗10 min，于凝膠紫外成像系統上觀察、拍照[11]。

1.8ISSR-PCR產物電泳結果統計及處理分析

將所得的瓊脂糖凝膠電泳圖譜用Quantity One軟件進行處理，對各泳道的DNA條帶進行分子量標記并輸出，以不同分子量DNA片段的條帶有無作為多態性狀，有記為1，無記為0，DNA凝膠電泳圖譜即轉換為[0，1]數字矩陣。然后利用NTSYS-PC軟件進行聚類分析，構建26個香菇菌株的親緣關系樹狀圖。

2結果與分析

2.1ISSR-PCR的引物篩選

一般來說，ISSR-PCR擴增所用引物是隨機且通用的，但是每個引物并非適合所有物種。由于引物是決定ISSR-PCR擴增成敗及其特異性的關鍵因素，因此對于某具體物種來說，應盡可能地對多個引物進行篩選，以篩選出擴增多態性水平高并且重復性好的引物。本研究首先從所保存的菌株中隨機選取香1310（菌株編號為4）和申香10號（菌株編號為11）2個菌株作為研究對象，以其DNA為模板，用隨機選取的106個引物進行PCR擴增，篩選到9個多態性高、重復性好、帶型清晰的引物，引物序列見表2。

2.226個香菇菌株ISSR-PCR擴增結果

利用篩選到的9個引物對26個香菇菌株的DNA進行ISSR-PCR，共檢測到124個擴增位點，其擴增片段DNA分子量大小主要介于0.2～4.5 kb之間。每個引物擴增的位點數介于11～17個，多態性比率介于78.6%～100.0%，9個引物擴增出的124個位點中，有111個為多態性，擴增位點平均多態性比率為89.5%（表3）。由此可見，本文所篩選的引物對香菇菌株的DNA擴增多態性豐富、穩定，可以用于香菇菌株間的親緣關系分析，構建其親緣關系聚類樹狀圖。引物ISSR 873和ISSR 895對26個香菇菌株的ISSR-PCR擴增圖譜見圖1和圖2。

M：Marker Ⅲ；B：空白；1～26：香菇菌株（見表1），下圖同。

2.326個香菇菌株的聚類分析

利用NTSYS-PC軟件對得到的26個香菇菌株的相似性[0，1]數字矩陣進行非加權配對算術平均法（UPMGA）聚類分析，得到這26個菌株的親緣關系樹狀圖，見圖3。可以看出，供試的26個香菇菌株相似性在0.55～0.88之間。在0.65的相似水平上可以將26個香菇菌株分為五組，其中55C（菌株編號為19）、虎皮香菇（菌株編號為25）分別自成一組，野生香菇（菌株編號為5）和SNL23（菌株編號為9）聚成一組，香菇（菌株編號為1）和WH021（菌株編號為2）聚成一組，其余20個香菇菌株聚為一組。55C是一個野生種與生產種的雜交菌株，與其它香菇親緣關系比較遠，故自成一組；虎皮香菇與香菇同屬香菇屬，但是不同種，故也自成一組；野生香菇（菌株編號為5）和SNL23（菌株編號為9）都是采自神農架的野生香菇，故聚成一組；香菇（菌株編號為1）和WH021（菌株編號為2）都是中高溫型、子實體較大的香菇，且與其它品種親緣關系較遠，故聚成一組；其余20個香菇菌株主要是常用的栽培菌株，故聚為一個大組。

3討論與結論

分子生物學技術的發展為在分子水平上研究菌種的親緣關系提供了技術保證。近年來，DNA技術已被廣泛用于真菌的系統發育研究，對香菇品種進行菌株鑒定可有助于從分子生物學角度準確地識別菌種[12]。目前用于親緣關系分析的DNA技術有很多，而ISSR技術具有操作簡單、成本低、條件穩定、快速、靈敏、檢測多態能力強、所需DNA模板量少等優點，目前已廣泛應用于植物遺傳多樣性和品種鑒定的研究[13]，在食用菌中的應用也日益廣泛。本研究利用ISSR-PCR技術對26個香菇菌株進行親緣關系聚類分析，結果顯示，26個香菇菌株的多態性較為豐富，在65%的相似水平上，可以分為5大類：55C、虎皮香菇分別自成一類，野生香菇和SNL23同是神農架的野生采集品種，聚成一類，香菇和WH021聚成一類，其余20個香菇菌株聚為一類。說明野生香菇和栽培香菇具有較遠的親緣關系，各香菇菌株間的親緣關系與其產地并無太大相關性。

本研究初步明確了本實驗室保存的26個香菇菌株親緣關系。但是由于香菇的栽培菌株特別多，栽培面積大，種植戶、菌種廠相互引種的現象特別多，所以遺傳背景比較復雜，僅采用一種分子生物學方法對菌株進行分析還遠不能滿足香菇遺傳信息庫和香菇遺傳育種工作的技術需求，今后還需要采用一些必要的輔助方法如菌絲形態、子實體形態以及出菇條件等，對更多的菌株進行系統分析和研究[14]。

參考文獻：

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[2]陳慧嬋，裴斐，楊文建，等.金針菇、香菇和蛹蟲草對小鼠體內抗氧化酶活性的影響[J].食品科學，2014，35（1）：219-223.

[3]江洪濤，李偉芳.香菇出口生產技術綜述[J].中國食用菌，2004，24（2）：3-5，53.

[4]謝雪迎，任鵬飛，朱常香，等.24個香菇菌株的鑒定與分類研究[J].山東農業科學，2009（12）：36-39.

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收稿日期：2017-06-18endprint