牛分枝桿菌esat6和cfp10蛋白的表達及在臨床檢測中的應用

解曉莉+韓猛+劉來興+王基隆+楊美+張云飛+丁家波+張亮+楊宏軍

摘要：本研究以牛分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模板，擴增esat6和cfp10基因，構建重組表達載體pET-32a（+）-esat6和pET-32a（+）-cfp10，并通過原核表達系統分別表達重組esat6和cfp10蛋白，經Ni-NTA親和層析法純化后，對目的蛋白進行SDS-PAGE和Western blot驗證，BCA法測定目的蛋白濃度，最后將east6和cfp10蛋白混合后用于牛結核病臨床檢測，并對檢測數據進行分析。結果表明，牛分枝桿菌esat6和cfp10蛋白在大腸桿菌系統中獲得高效表達；其混合蛋白應用于結核病檢測具有較高的特異性，且在皮膚變態反應和IFN-γ釋放試驗兩種檢測方法中具有較高的符合率。說明相較于提純結核菌素（PPD），esat6和cfp10混合蛋白具有較高的特異性和穩定性，將有希望替代PPD用于牛結核病檢測。

關鍵詞：牛分枝桿菌；esat6和cfp10蛋白；皮膚變態反應；IFN-γ釋放試驗

中圖分類號：S858.23文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2017）11-0120-04

Expression and Clinical Significance of

Mycobacterium bovis esat6 and cfp10 Protein

Xie Xiaoli1， Han Meng1， Liu Laixing1， Wang Jilong1， Yang Mei1，

Zhang Yunfei1， Ding Jiabo2， Zhang Liang1， Yang Hongjun1

（1. Dairy Cattle Research Center， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250000， China；

2. China Institute of Veterinary Drugs Control， Beijing 100081， China）

AbstractIn this study， the esat6 and cfp10 gene were cloned with genomic DNA of Mycobacterium bovis strain H37Rv as template. Recombinant expression vectors pET-32a（+）-esat6 and pET-32a（+）-cfp10 were constructed to express esat6 and cfp10 protein through the prokaryotic expression system. The recombinant proteins were purified by Ni-NTA affinity chromatography and verified with SDS-PAGE and Western blot. Furthermore， the protein concentrations were determined with BCA method. Then the two proteins were mixed to detect the BTB （bovine tuberculosis） and the results were analyzed. The results showed that esat6 and cfp10 protein were highly expressed in E. coli. There were high specificity and coincidence rate in skin allergic reaction and IFN-γ release test using mixed protein as stimulator. This study confirmed that compared with PPD， esat6 and cfp10 mixed protein had higher specificity and stability and was a promising alternative in BTB detection.

KeywordsMycobacterium bovis； esat6 and cfp10 protein； Skin allergic reaction； IFN-γ release test

牛結核病（bovine tuberculosis）是由牛型分枝桿菌引起的一種人畜共患慢性消耗性傳染病，在世界各國均有發生[1]。OIE將該病列為B類動物疫病，其廣泛傳播流行，直接影響著畜牧業的發展，威脅人類健康，危害公共衛生安全[2]。目前牛結核病的診斷方法主要有提純結核菌素（PPD）皮膚變態反應及IFN-γ釋放試驗。然而，由于PPD與卡介苗（BCG）及部分環境分枝桿菌存在抗原交叉，所以特異性較低，為了排除交叉反應的干擾，近年的研究更傾向于尋找特異性抗原。

esat6、cfp10是牛分枝桿菌的主要毒力因子，能夠誘導宿主細胞的凋亡，同時還是重要的T細胞抗原，能夠誘導機體產生記憶性免疫應答[3]。基因組學研究證實，esat6、cfp10均位于RD1區，該區僅存在于MTB等致病性分枝桿菌中，而不存在于BCG及其它非致病性分枝桿菌中[4，5]，因此可以排除交叉反應，其作為診斷性抗原具有更好的特異性。esat6、cfp10作為分子伴侶以異二聚體的形式從胞內分泌出來，這種結構與蛋白質活性有密切關系，本試驗把兩者按照1∶1的比例進行混合更符合牛分枝桿菌的生物學特性，這也在一定程度上提高了其作為診斷抗原的敏感性。本研究通過原核表達系統表達esat6和cfp10蛋白，并將其以1∶1的比例混合后用于牛結核病臨床檢測，以評價其檢測應用價值。

1材料與方法

1.1材料與試劑

牛分枝桿菌標準株H37Rv基因組DNA由中國獸醫藥品監察所提供；pEASY-T3克隆載體、感受態DH5α、BL21（DE3）、蛋白質Marker均購自北京TransGen Biotech；pET-32a（+）由本實驗室保存；限制性內切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ及DNA Marker均購于大連寶生物工程有限公司；Anti-His antibody（His-2）購自Sigma公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術研究所；DNA回收試劑盒和質粒抽提試劑盒均購自北京TianGen Biotech ；其余試劑為國產分析純。

1.2試驗方法

1.2.1目的基因克隆根據NCBI中esat6和cfp10基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設計兩對引物，由上海生工技術有限公司合成。其中esat-6上游序列為：5′-ccggatccatgacagagcagtggaatttcg-3′（劃線處為BamH Ⅰ酶切位點），下游序列為：5′-cggaattctgcgaacatcccagtgacgttg-3′（劃線處為EcoR Ⅰ酶切位點）；cfp-10上游序列為：5′-cggaattcgcagagatgaagaccgatgc-3′（劃線處為EcoR Ⅰ酶切位點），下游引物序列為：5′-ggaagctttcagaagcccatttgcgag-3′（劃線處為Hind Ⅲ酶切位點）。

以牛分枝菌標準株H37Rv基因組DNA為模板，擴增esat6和cfp10基因，瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，連接至pEASY-T3載體，轉化感受態DH5a，進行藍白斑篩選擴大克隆，抽提重組質粒進行雙酶切鑒定[6]，陽性質粒分別命名為pEASY-T3-esat6和pEASY-T3-cfp10并送上海生工有限公司測序。

1.2.2重組esat6蛋白和cfp10蛋白的表達與鑒定重組質粒和pET-32a（+）質粒經相應限制性內切酶酶切處理后，連接轉化至BL21。經酶切和測序鑒定，將陽性菌株分別命名為pET32a（+）-esat6/BL21和pET32a（+）-cfp10/BL21。取陽性菌株培養，經IPTG（終濃度為0.5 mmol/L）30℃誘導6 h，同時設空載體對照。10 000 r/min離心10 min收集菌體，經超聲裂解后離心收集上清，進行SDS-PAGE鑒定，同時利用His單抗進行Western blot分析。

1.2.3esat6和cfp10蛋白純化與濃度測定利用Ni-NTA親和層析法對His-esat6和His-cfp10蛋白進行純化，并通過SDS-PAGE對其純化效果進行鑒定。利用BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型）對純化蛋白濃度進行測定。

1.2.4esat6和cfp10在臨床診斷中的應用將純化得到的目的蛋白用 HanksBalanced Salt Solution稀釋至終濃度為50 μg/mL，分裝，-80℃凍存。挑選50頭健康的荷斯坦泌乳牛，分別頸部注射結核菌素（50 μg/mL）和esat6+cfp10混合蛋白（esat6∶cfp10=1∶1，esat6和cfp10濃度均為25 μg/mL）進行皮膚變態反應試驗，同時觀察牛頸部的炎癥反應，篩選出的陽性牛和可疑牛采集抗凝血進一步開展IFN-γ試驗。皮膚變態反應操作方法及判定標準參照《動物結核病診斷技術（GB/T 18645—2002）》。

1.3檢測數據分析

將收集的檢測數據利用Kappa系數進行統計學分析。

2結果與分析

2.1esat6和cfp10基因的PCR擴增

以牛分枝桿菌標準株H37Rv基因組DNA為模板，分別擴增得到288 bp和303 bp的預期大小片段（圖1）。

2.2esat6和cfp10重組質粒的鑒定

esat6和cfp10重組質粒經BamHⅠ、EcoRⅠ和EcoRⅠ﹑HindⅢ雙酶切鑒定，分別得到288 bp和303 bp的目的片段，BLSAT比對結果顯示兩基因與NCBI公布的相應序列同源性均為100%，兩基因重組質粒均構建正確（圖2）。

重組質粒的酶切鑒定

2.3His-esat6和His-cfp10蛋白的表達與鑒定

將原核表達產物經SDS-PAGE（圖3A）與Western blot（圖3B）分析顯示，His-esat6和His-cfp10蛋白均已表達，且大小與預期大小（分別為28 kD和29 kD）一致。

2.4esat6和cfp10蛋白的濃度測定

利用試劑盒中的蛋白標準品制作標準曲線（圖4），根據方程y=0.2317x+0.1249及目的蛋白的OD值0.228和0.352，得到esat6和cfp10蛋白含量分別為：444.97 μg/mL和980.15 μg/mL。

2.5esat6和cfp10在臨床診斷中的應用

將待檢測蛋白進行牛頸部注射后72 h進行復檢，陽性牛肉眼可見注射部位腫脹堅硬，觸摸敏感。在皮膚變態反應中，PPD的陽性檢出率為38%，混合蛋白的陽性檢出率為30%。Kappa系數分析顯示，在以混合蛋白及提純結核菌素作為刺激劑的皮膚變態反應和IFN-γ釋放試驗中，兩兩間均具有顯著相關性。不同刺激物和不同檢測方法的符合率均較高（表1）。

3討論

牛結核病是一種慢性消耗性傳染病，呈世界流行性，且無明顯季節性，在流行嚴重的地區感染率可達60%[7]。esat6和cfp10抗原僅存在于致病性分枝桿菌的早期培養濾液中，沒有信號肽，是兩種非信號肽依賴的結核分枝桿菌分泌性小分子量抗原[8]，能誘導機體產生高水平IFN-γ[9]和強烈的DTH反應[10]，在牛結核病的診斷、預防中起著重要作用。east6和cfp10從胞內分泌時形成1∶1緊密的異二聚體結構，這種結構有利于調控蛋白活性，增加蛋白與蛋白之間相互作用的特異性[8]。因此，本研究在試驗過程中對esat6與cfp10按照1∶1的比例進行混合，以發揮兩者最大的生物學功能，提高檢測的靈敏性。

對牛只進行皮膚變態反應試驗，檢測結果顯示，PPD的陽性檢出率為38%，而esat6和cfp10混合蛋白的陽性檢出率為30%，且兩者具有高達92%的整體符合率，這表明PPD檢測可能具有較強的敏感性，陽性檢出率較高，但PPD是全菌蛋白的抽提物，成分復雜，與卡介苗（BCG）及環境中其它分枝桿菌存在抗原交叉反應[11]，檢測假陽性的風險較大。從IFN-γ釋放試驗的結果分析，PPD作為刺激物的皮膚變態反應與IFN-γ釋放試驗的符合率為78.95%，而以esat6和cfp10混合蛋白作為刺激物的皮膚變態反應與IFN-γ釋放試驗的符合率為89.47%，這表明esat6和cfp10的可重復性、特異性更高，檢出結果更符合牛群的感染狀況。這也從側面反映了PPD作為檢測抗原存在較高的假陽性，與Aagaard等[12]的研究結論相符合。

雖然IFN-γ分泌的靈敏度能夠達到pg級[13]，特異性也高達100%，同時IFN-γ釋放試驗作為牛結核病診斷的最佳方法，是皮膚變態反應無法比擬的，但是IFN-γ釋放試驗的體外操作過程復雜，作為臨床快速診斷試劑應用有一定的局限性；而PPD作為檢測抗原存在較高的假陽性；若能將esat6和cfp10混合蛋白替代PPD，可以提高診斷的特異性，降低檢測的假陽性率，這必將有良好的應用前景。

參考文獻：

[1] 蔡寶祥. 家畜傳染病學[M]. 第四版.北京： 中國農業出版社， 2001：110-111.

[2]Pollock J M， Welsh M D， McNair J. Immune responses in bovine tuberculosis： towards new strategies for the diagnosis and control of disease[J]. Vet. Immunol. Immunop.， 2005， 108（1）： 37-43.

[3]Skjt R L， Oettinger T， Rosenkrands I， et al. Comparative evaluation of low-molecular-mass proteins from Mycobacterium tuberculosis identifies members of the ESAT-6 family as immunodominant T-cell antigens[J]. Infect Immun.， 2000， 68（1）： 214-220.

[4]Mahairas G G， Sabo P J， Hickey M J， et al. Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent M. bovis [J]. J. Bacteriol.， 1996， 178（5）： 1274-1282.

[5]Joung S M， Jeon S J， Lim Y J， et al. Complete genome sequence of Mycobacterium bovis BCG Korea， the Korean vaccine strain for substantial production[J]. Genome Announc.， 2013， 1（2）： e0006913.

[6]薩姆布魯克J，拉塞爾D W. 分子克隆實驗指南 [M]. 第三版. 黃培堂等譯. 北京： 科學出版社， 2008.

[7]劉思國， 王春來， 張秀華，等. 牛結核病病原生態學和流行病學研究[J].中國畜牧獸醫， 2005， 32（3）： 60-62.

[8]Sorensen A L， Nagai S，Hoven G， et al. Purification and characterization of a low-molecular-mass T-cell antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis[J]. Infect Immun.， 1995， 63（5）： 1710-1717.

[9]Colangeli R， Spencer J S， Bifani P， et al. MTSA10， the product of the Rv3874 gene of Mycobacterium tuberculosis， elicits tuberculosis-specific， delayed-type hypersensitivity in guinea pigs[J]. Infect Immun.， 2000， 68（2）： 990-993.

[10]Philipp W J， Nair S， Guglielmi G， et al. Physical mapping of Mycobacterium bovis BCG Pasteur reveals differences from the genome map of Mycobacterium tuberculosis H37Rv and from Mycobacterium bovis [J]. Microbiology， 1996， 142（11）：3135-3145.

[11]Michae D， Welsh， Rodat T， et al. Influence of pathological progression on the balance between cellular and humoral immune responses in bovine tuberculosis[J]. Immunology， 2004， 114（1）： 101-111.

[12]Aagaard C， Govaerts M， Meikle V， et al. Optimizing antigen cocktails for detection of Mycobacterium bovis in herds with different prevalences of bovine tuberculosis： ESAT6-CFP10 mixture shows optimal sensitivity and specificity [J]. J. Clin. Microbiol.， 2006， 44（12）： 4326-4335.

[13]Fine P E， Sterne J A， Ponnighaus J M， et al. Delayed-type hypersensitivity reaction mycobacterial vaccines and protective immunity[J]. Lancet， 1994， 344 （8932）： 1245-1249.山 東 農 業 科 學2017，49（11）：124～126，161Shandong Agricultural Sciences山 東 農 業 科 學第49卷第11期李福偉，等：LED燈對蛋雞生產性能的影響及節能效果分析DOI：10.14083/j.issn.1001-4942.2017.11.024

收稿日期：2017-09-02

基金項目：國家現代蛋雞產業技術體系濟南綜合試驗站項目（CARS-40-S12）；雞蛋生產質量安全控制技術研究與示范（201608）；畜禽健康養殖關鍵技術研究（CXGC2017B02）；濟南市畜牧科技與良種推廣能力建設項目“蛋雞標準健康養殖技術”；山東省財政支持農業技術推廣項目“蛋雞標準化健康養殖技術推廣”

作者簡介：李福偉（1977—），男，副研究員，碩士，主要從事家禽育種與生產技術研究。E-mail：lifuwei1224@163.com

通訊作者：黃保華（1964—），男，研究員，本科，主要從事家禽營養學研究。E-mail：jqsyzs@163.com