小麥腐霉根腐病原鑒定Ⅱ

張悅麗+齊軍山+張博+馬立國+徐作珽+李長松+祁凱

摘要：2015年冬小麥返青期，山東單縣冬小麥出現(xiàn)葉片變黃、植株矮小，毛細(xì)根上出現(xiàn)開水燙過的水漬狀，造成了部分死苗現(xiàn)象，點(diǎn)片發(fā)生。為明確病原和有效防治該病害，本研究對病原菌進(jìn)行分離培養(yǎng)、致病性測定、形態(tài)學(xué)觀察及分子生物學(xué)鑒定。結(jié)果表明，山東單縣冬小麥根腐病（稱為腐霉根腐病）由瓜果腐霉Pythium aphanidermatum引起。

關(guān)鍵詞：腐霉根腐病；瓜果腐霉；冬小麥

中圖分類號：S435.121.4+7文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2017）11-0095-03

Identification of Pathogen Causing Wheat Root RotⅡ

Zhang Yueli， Qi Junshan， Zhang Bo， Ma Liguo， Xu Zuoting， Li Changsong， Qi Kai

（Institute of Plant Protection， Shandong Academy of Agricultural Sciences/

Shandong Provincial Key Laboratory of Plant Virology， Jinan 250100， China）

AbstractA disease was observed on winter wheat in Shanxian of Shandong Province at the returning green stage in 2015. The infected wheat seedlings showed yellow leaves，dwarf plants and water-soaked capillary roots， and some seedlings died. The disease occurred in spots and patches. To identify the pathogen and control the disease effectively， the pathogenic bacterium was isolated from the infected wheat roots. Based on its morphology biological characteristics， pathogenicity and molecular biology identification， the pathogen was identified as Pythium aphanidermatum.

KeywordsPythium root rot； P. aphanidermatum； Winter wheat

小麥腐霉根腐病是世界性病害，現(xiàn)全國均有分布。小麥?zhǔn)艿礁咕秩竞螅党１憩F(xiàn)為變褐腐爛，地上部分生長不良，產(chǎn)量降低，種子和幼苗在出土前就可霉?fàn)€和死亡。近年來，山東菏澤單縣冬小麥返青后出現(xiàn)了外圍葉片萎蔫的癥狀，呈點(diǎn)片發(fā)生，發(fā)病輕的植株根系水漬狀，似開水燙過，發(fā)病重的植株根部變褐腐爛，地上部分生長不良，造成了死苗現(xiàn)象。本研究通過病原菌分離、致病性測定、形態(tài)特征及分子鑒定，明確引起冬小麥根腐病（稱其為小麥腐霉根腐病）的病原，以期為該病害發(fā)生規(guī)律的探究和綜合防治措施的制定提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1樣品采集

2014年2—3月于山東單縣冬小麥田調(diào)查病害發(fā)生和危害情況，對田間病株癥狀進(jìn)行觀察記載，采集葉片萎蔫變黃甚至死亡的典型植株，備用。

1.2病原菌的分離、培養(yǎng)及純化

病原菌分離采用組織分離法。將病株水漬狀毛細(xì)根剪成0.5～1.0 cm小段，用自來水沖洗24 h，0.05%次氯酸鈣溶液消毒10 min，放入WA平板28℃培養(yǎng)24～48 h，采用單孢分離法進(jìn)行分離純化，轉(zhuǎn)移到CMA培養(yǎng)基上，將純化好的菌株SDHZ-1保存?zhèn)溆谩?/p>

WA培養(yǎng)基：瓊脂粉18 g，用去離子水混合配制 1 000 mL。

CMA培養(yǎng)基：玉米粉60 g，60℃水浴2 h，過濾取濾液，瓊脂粉18 g，用去離子水混合配制 1 000 mL。

1.3致病性測定

將SDHZ-1轉(zhuǎn)移到CMA平板上28℃暗培養(yǎng)7 d。將沙土和塑料盆用甲醛消毒。將培養(yǎng)好的SDHZ-1菌株接種到滅菌玉米粒上培養(yǎng)7 ～10 d，制成菌劑。菌劑與滅菌沙土（菌∶沙土質(zhì)量比為5∶100）混合均勻后，裝入消毒的塑料盆內(nèi)，取健康小麥種子（品種為濟(jì)麥22）催芽后，種植在塑料盆內(nèi)，每盆種植10株，10～15℃培養(yǎng)。對照接種滅菌玉米粒。觀察并記錄發(fā)病情況，待發(fā)病后，將根取出，取有水漬癥狀的小麥根，分離致病菌，觀察與接種菌是否一致。

1.4病原菌形態(tài)觀察

將SDHZ-1在CMA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，觀察菌落形態(tài)特征。將SDHZ-1在WA平板上暗培養(yǎng)，2 d后移取邊緣菌絲至皮氏（Petris）培養(yǎng)液中，28℃培養(yǎng)2～5 d挑取孢子囊，觀察孢子囊形態(tài)，測量孢子囊大小。待出現(xiàn)藏卵器、雄器、卵孢子后，觀察藏卵器及雄器的形態(tài)和著生位置、配合情況及卵孢子的形態(tài)特征，每項(xiàng)指標(biāo)分別觀察測量50個(gè)，計(jì)算平均值。

1.5病原菌分子生物學(xué)鑒定

1.5.1病原菌DNA的提取將供試菌株接種到CMA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)5 d，收集菌絲。基因組DNA的提取和純化采用CTAB法，并置于-20℃冰箱中備用。

1.5.2COⅠ基因擴(kuò)增PCR反應(yīng)在ABI 2720 PCR儀上進(jìn)行。使用50 μL PCR反應(yīng)體系：緩沖液（20 mmol KCl， 10 mmol （NH4）2SO4，2 mmol MgCl2，20 mmol Tris-HCl， pH 8.4）、dNTP各200 μmol，腐霉菌特異性引物FM52R （5′-TTAGAATGGAATTAGCACAAC-3′， FM55 （5′-GGCATACCAGCTAAACCTAA-3′）各15 pmol，Taq DNA聚合酶2.5 units、模板DNA 100 ng。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；94℃變性40 s，54℃退火50 s，72℃延伸70 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。在每次反應(yīng)中設(shè)陰性對照（不含模板DNA）。

1.5.3PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序和序列分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA試劑盒純化回收后，送上海生工進(jìn)行測序。將測序結(jié)果在GenBank上與已發(fā)表的基因進(jìn)行同源性比對。

2結(jié)果與分析

2.1小麥腐霉根腐病癥狀及致病性測定

小麥腐霉根腐病最初在田間呈點(diǎn)狀發(fā)生，植株矮小，病株周圍的小麥也逐漸受到侵染發(fā)病。SDHZ-1能侵染冬小麥種子，引起種子腐爛，降低出苗率；苗期冬小麥?zhǔn)艿降角秩竞螅刀绦。紊鶞p少（圖1B），地上部分矮化，鮮重減輕，第一片葉卷曲，葉片不能正常伸展（圖1A）。

A：人工接菌SDHZ-1地上部癥狀；B：人工接菌SDHZ-1根部癥狀

圖1人工接菌癥狀

2.2形態(tài)特征觀察

SDHZ-1菌株的孢子囊由姜瓣?duì)罨虿灰?guī)則菌絲構(gòu)成，常為膨大的菌絲狀結(jié)構(gòu)，頂生或間生。藏卵器球形，直徑17.5～31.3（av. 23.3）μm，光滑，多頂生，偶爾間生或直接從菌絲上長出，柄較直。雄器細(xì)胞屋頂狀、袋狀、寬棍棒狀、瓢狀或玉米粒狀，每個(gè)藏卵器有1～2個(gè)雄器，雄器多數(shù)以頂端、偶爾以側(cè)面與藏卵器接觸。卵孢子球形，直徑15～28.8（av. 20.6）μm，不滿器，偶爾幾乎滿器，單生。該菌株的形態(tài)特征與余永年描述的P. aphanidermatum基本一致[1]。

2.3序列分析

經(jīng)FM52R和FM55引物對擴(kuò)增COⅠ序列，從SDHZ-1菌株基因組中擴(kuò)增獲得1 106 bp的序列，在Genebank中進(jìn)行序列一致性比較。結(jié)果表明，SDHZ-1的COⅠ序列與P. aphanidermatum （Genebank號：HQ708485）的同源性為100%。

利用 Mega5.2.2 軟件對不同菌株COⅠ 序列進(jìn)行進(jìn)聚類分析，結(jié)果表明供試菌株SDHZ-1與P. aphanidermatum （ GenBank 號：HQ708485）為同一分支，進(jìn)化距離最近（圖 2）。根據(jù)病原菌的形態(tài)特征及COⅠ序列同源性比較結(jié)果，鑒定SDHZ-1為瓜果腐霉P. aphanidermatum。

3討論與結(jié)論

Vanterpool最早于19世紀(jì)30年代在加拿大發(fā)現(xiàn)Pythium arrhenomanes 等常可導(dǎo)致谷物根腐病。我國已報(bào)到的小麥根腐病病菌有麥根腐平臍蠕孢Bipolaris sorokiniana、尖孢鐮孢菌Fusarium oxysporum、層出鐮孢菌Fusarium proliferatum、黃色鐮孢菌Fusarium culmorum等[2]，由腐霉菌引起的小麥根腐病國內(nèi)研究的較少。而余永年等[3]對我國不同植被土壤中腐霉菌種類及其數(shù)量分布做了大量研究后發(fā)現(xiàn)，大田土（包括麥類土等）中腐霉數(shù)量僅次于菜田土，并從中分離到了15種腐霉菌；在禾谷類區(qū)系中，以瓜果腐霉P. aphanidematum、強(qiáng)雄腐霉P. arrehenomanes、禾生腐霉P. graminicola和終極腐霉P. ultimum較為豐富。1989—1990年，王政逸等[4]從浙江省各冬小麥產(chǎn)區(qū)的病株和麥田土壤中分離鑒定了5個(gè)腐霉種，并對其做了致病性研究。經(jīng)分離和致病性檢測，浙江省引起大、小麥根腐病的腐霉菌包括P. dissotocum、P. irregulare、P. polypapillatum、P. spinosum和P. ultimum 5種[5]，均能引起供試大、小麥的根腐、根褐變和壞死，第一片葉卷曲，抑制植株生長，造成植株各部不同程度的矮化和變短，與本研究中分離的病原菌——瓜果腐霉P. aphanidematum致病性測定時(shí)癥狀相似。

由瓜果腐霉菌P. aphanidematum引起的病害國內(nèi)研究的較多。徐作珽等[6]研究發(fā)現(xiàn)瓜果腐霉P. aphanidematum可引起玉米典型的青枯癥狀，并認(rèn)為山東玉米莖基腐病的病原菌以瓜果腐霉P. aphanidematum為主，與禾谷鐮刀菌F. graminearum復(fù)合侵染時(shí)引發(fā)的病害更為嚴(yán)重。本研究從山東單縣冬小麥區(qū)感病小麥植株根部分離的病原菌，經(jīng)形態(tài)和分子鑒定為瓜果腐霉P. aphanidematum，有關(guān)該病害的發(fā)生流行規(guī)律、侵染循環(huán)及防治措施等還需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]余永年. 中國真菌志（第六卷.霜霉目）[M]. 北京： 科學(xué)出版社， 1998.

[2]張德珍， 李鵬昌， 陳曉霞，等. 山東省小麥根腐病病原菌的分離鑒定 [J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)， 2016， 43（2）： 233-240.

[3]余永年， 馬國忠， 劉曉娟. 腐霉屬分類性狀評價(jià)及中國的種[J]. 真菌學(xué)報(bào)， 1990， 9（4）： 249-262.

[4]王政逸， 張炳欣， 樓兵干. 浙江省小麥根圍土壤（Pythium spp.）的一些生態(tài)學(xué)研究[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 1996， 26（1）： 29-35.

[5]沈杰， 張炳欣. 浙江省大、小麥直徑腐霉的研究[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 1994， 24（2）： 107-112.

[6]徐作珽， 張傳模. 山東玉米莖基腐病病原菌的初步鑒定[J].植物病理學(xué)報(bào)， 1985，15（2）： 103-108.山 東 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué)2017，49（11）：98～104Shandong Agricultural Sciences山 東 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué)第49卷第11期徐偉麗，等：3種三萜類化合物對黃胸散白蟻生物活性及纖維素酶的影響DOI：10.14083/j.issn.1001-4942.2017.11.019