刺五加皂苷對淀粉樣前體蛋白APP酶解通路的影響

劉 芳，李凈洋，邱 燁，許妍姬

(延邊大學醫(yī)學院 預防醫(yī)學教研室，吉林 延吉133002)

刺五加皂苷對淀粉樣前體蛋白APP酶解通路的影響

劉 芳，李凈洋，邱 燁，許妍姬*

(延邊大學醫(yī)學院 預防醫(yī)學教研室，吉林 延吉133002)

目的研究刺五加皂苷對APP(Amyloid Precursor Protein，APP)酶解通路的影響。方法(2015.9-2016.5)用12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L刺五加皂苷處理胚鼠皮層神經(jīng)元細胞，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測γ-分泌酶活性；另用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染構(gòu)建APP695高表達CHO細胞系,用G418(500 mg/L)進行篩選獲得APP695-CHO穩(wěn)轉(zhuǎn)染細胞，用12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L刺五加皂苷處理穩(wěn)轉(zhuǎn)染細胞，48 h后，ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中Aβ1-40含量，用Western-blot法檢測細胞裂解液中APP-N端片段蛋白的表達。結(jié)果在胚鼠皮層神經(jīng)元細胞與對照組相比，25 mg/L、50 mg/L的刺五加皂苷能夠抑制內(nèi)源性γ-內(nèi)切酶的活性，而且隨著濃度的升高，抑制作用增強；在APP695-CHO穩(wěn)轉(zhuǎn)染細胞中，Aβ1-40的分泌量增高，APP-N端片段的蛋白表達水平減少，不同劑量刺五加皂苷能緩解這些變化。結(jié)論刺五加皂苷能抑制內(nèi)源性γ-內(nèi)切酶減少Aβ1-40的生成，對APP酶解起到一定的影響，對阿爾茨海默病的發(fā)病及進展有一定的保護作用。

刺五加皂苷；β淀粉樣蛋白；γ-內(nèi)切酶；阿爾茨海默病；APP-N端片段

(ChinJLabDiagn,2017,21:2173)

1 材料與方法

1.1材料

CHO細胞株來自于上海良一醫(yī)藥科技有限公司。APP695是由韓國首爾醫(yī)科大學藥理學教室徐裕憲教授饋贈。刺五加皂苷購于上海源葉生物科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO)、LB培養(yǎng)基、DAPT(γ-內(nèi)切酶抑制劑)、G418、青霉素、鏈霉素、氨芐青霉素(Amp)、DH-5α購于碧云天生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)液、青霉素、鏈霉素、氨芐青霉素(Amp)、胰蛋白酶(Sigma);胎牛血清(Corning，N.Y,14831，USA)；NDiff Neuro-2(N2)培養(yǎng)基補充劑購于德國默克密理博公司； QIAGEN Plasmid Maxi Kit 購于QIAGEN; Lipofectin2000從invitrogen公司購買；人β淀粉樣蛋白1-40(Aβ1-40)酶聯(lián)免疫分析、大鼠γ-分泌酶(γ-Secretase)酶聯(lián)免疫分析試劑盒購于上海酶聯(lián)(mlbio)生物公司。

1.2實驗儀器

CO2培養(yǎng)箱、低速容量離心機、電泳儀、立式壓力蒸汽滅菌器、冷凍離心機、恒溫培養(yǎng)箱、酶標儀、恒溫振蕩器、紫外分光光度計等均由延邊大學醫(yī)學院預防醫(yī)學教研室提供。

1.3實驗方法

1.3.1質(zhì)粒的擴增和抽提

把含有重組質(zhì)粒V-Flag-APP695和空載體V-Flag的菌種放入含氨芐青霉素(Amp)的固體培養(yǎng)基中，先經(jīng)過小培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)入到大培養(yǎng)。根據(jù)質(zhì)粒抽提試劑盒來提取質(zhì)粒，并測定質(zhì)粒的濃度和純度。

要形成以學生為主體的教學課堂，使學生作為課堂知識的主要吸收者和接受者。通過課堂教學發(fā)表自身的意見和看法，并從每節(jié)課的學習中不斷積累自身的知識儲備。語文作為一門從小就接觸的學科，對學生的成長成才起著關鍵的作用。因此，學生在學習語文的過程中要擺正自身的姿態(tài)，積極主動地去學習和探索語文的知識。例如，關于作文的寫作方面，在寫到關于人文素養(yǎng)題材的作文時，教師可以引用一些有關此題材的故事，或優(yōu)秀作文，讓學生自主進行討論，從中汲取此類題材的關鍵點進行構(gòu)思和框架的構(gòu)建，這也是提升個人人文素養(yǎng)的一個途徑。

1.3.2CHO細胞培養(yǎng)

把CHO細胞培養(yǎng)于37℃、5% CO2條件下的二氧化碳培養(yǎng)箱中。

1.3.3細胞轉(zhuǎn)染

依照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，把APP695基因轉(zhuǎn)染到CHO細胞中，用G418(500 mg/L)篩選陽性克隆，再用Western-blot檢測APP-N端片段蛋白的表達。

1.3.4胚鼠皮層神經(jīng)元細胞培養(yǎng)

取懷孕16-18 d的SD大鼠，乙醚麻醉取出胚胎，放入D-hank’s液中，將胎鼠斷頭取大腦皮層組織，將其剪碎消化分解后，終止消化，離心去上清，再用DMEM培養(yǎng)液吸打靜止后，接種到六孔板中，于CO2培養(yǎng)箱中過夜，次日換成有1%N2的DMEM培養(yǎng)液，第四天再換成含有10%胎牛血清、5%馬血清的DMEM培養(yǎng)液，7 d后給予續(xù)處理。

1.3.5放射免疫法測定Aβ1-40含量

空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對照組、12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L的刺五加皂苷和γ-內(nèi)切酶抑制劑5 μmol/L DAPT分別處理轉(zhuǎn)染后的細胞，48 h后收集細胞培養(yǎng)液，依照人β淀粉樣蛋白1-40(Aβ1-40)酶聯(lián)免疫試劑盒的要求測定Aβ1-40的含量。

1.3.6ELISA法測定γ-內(nèi)切酶活性

分別向胚鼠神經(jīng)元細胞中加入12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L的刺五加皂苷，48 h后收集培養(yǎng)液，按照γ-分泌酶ELISA試劑盒的說明書操作，酶標儀測定吸光度，計算得出γ-內(nèi)切酶的濃度。

1.3.7APP-N端片段蛋白水平檢測

采用蛋白印跡法測定蛋白水平。細胞獲取蛋白后進行電泳實驗，以β-tubulin作為內(nèi)參照，計算蛋白表達水平。

1.3.8統(tǒng)計分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，計量資料以表示，多個樣本均數(shù)比較，采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1Aβ1-40含量比較轉(zhuǎn)染APP695-V-Flag模型組與轉(zhuǎn)染空載體V-Flag對照組比較，Aβ1-40的含量明顯增加(P<0.05，表1)；DAPT處理組、刺五加皂苷低、中、高劑量組與模型組相比，Aβ1-40含量明顯降低，具有顯著性差異(P<0.05)。

表1 刺五加皂苷對CHO/APP695細胞中Aβ1-40含量的影響

與對照組比較，△代表P<0.05；與模型組比較，*代表P<0.05

2.2刺五加皂苷對γ-內(nèi)切酶活性的影響胚鼠皮層原代培養(yǎng)細胞DAPT處理組跟空白對照組比較，γ-內(nèi)切酶活性明顯下降；刺五加低、中、高劑量組γ-內(nèi)切酶活性與空白對照組比較明顯降低(P<0.05,表2)。

表2 刺五加皂苷對胚鼠神經(jīng)元細胞內(nèi)源性γ-內(nèi)切酶活性的影響

與正常對照組比較，*代表P<0.05

2.3APP-N端片段蛋白表達水平測定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒V-Flag-APP695組比轉(zhuǎn)染空載體V-Flag組蛋白表達水平明顯增加，DAPT+APP695處理組比APP695處理組蛋白表達水平有所增加，刺五加皂苷(低、中、高)+APP695處理組與APP695模型組相比較，APP-N端蛋白表達水平升高,具有顯著性差異(P<0.05，圖1)。

*代表與模型組比較P<0.05,#代表與對照組比較P<0.05

3 討論

阿爾茨海默病(AD)是β淀粉樣蛋白(amyloid-β protein，Aβ)積累的結(jié)果，是淀粉樣前體蛋白(APP)經(jīng)β和γ-分泌酶水解而產(chǎn)生[6]，而γ-分泌酶切割APP產(chǎn)生的疏水性Aβ40是形成Aβ的主要原因，所以γ-內(nèi)切酶是APP水解產(chǎn)生Aβ的關鍵酶，是防治阿爾茨海默病很有潛力的靶點。γ-分泌酶是產(chǎn)生Aβ的限速酶，直接關系到AD的發(fā)病與否，能切割各種Ⅰ型跨膜蛋白,包括 APP 和 CD44等[7,8]。

γ-分泌酶抑制劑(GSIS)已用于臨床研究,但如DAPT或其他γ-分泌酶抑制劑和β-分泌酶抑制劑，由于藥物用藥的安全性以及其長時間應用時出現(xiàn)的副作用，不適于長期使用。所以我們必須找到長期比較安全使用的一些組分，這些保護成分可以來自從中草藥或微量元素或食品。因此，本次研究我們觀察了刺五加皂苷對APP的酶解途徑的影響。結(jié)果顯示，刺五加皂苷可以抑制γ-內(nèi)切酶的活性，進而減少Aβ1-40的產(chǎn)生，其APP-N端蛋白表達水平升高。在HT22細胞和穩(wěn)定表達Sweidish 突變型APP的SH-SY5Y細胞中，Shi Chung等人報道人參皂甙Rg1促進APP非淀粉樣酶切通路，增加α-分泌酶的活性以及細胞外的Aβ1-40和分泌型sAPP(α)的含量，闡明了人參皂甙Rg1對老年性癡呆酶解通路的干預作用[9]。Koivisto等人報道魚油含EPA和DHA，可以緩解老年性癡呆模型APPswe/PS1dE9 轉(zhuǎn)基因小鼠的認知障礙和腦部淀粉樣蛋白的沉積，其機制為降低β-分泌酶和γ-分泌酶的活性減少Aβ1-42的含量[10]。我們的研究結(jié)果與這些結(jié)果保持一致性，刺五加皂苷抑制γ-內(nèi)切酶的活性，進而減少Aβ1-40的產(chǎn)生，干預老年性癡呆酶解通路，可以起到預防和治療老年性癡呆有保護作用。

刺五加皂苷具有調(diào)控心腦血管系統(tǒng)，抑制癌細胞增殖，降低糖尿病，抗炎，增強免疫力，抗疲勞等藥理作用[11]。刺五加含有超氧化物歧化酶復合物，具有很好的抗氧化功能，可增強免疫力和抗自由基的作用[12]。刺五加皂苷E 和異秦皮啶對Aβ25-35誘導的軸突和樹突的萎縮具有明顯的保護作用[13]。刺五加皂苷能顯著抑制α-synuclein誘導的毒性[14]。刺五加提取物可提高紋狀體多巴胺(DA)含量，平衡紋狀體的行為激活和抑制作用，保護DA神經(jīng)元凋亡，減輕帕金森病小鼠的死亡率[15]。之前，我們研究組通過體內(nèi)和體外實驗表明了刺五加對老年性癡呆的保護作用，刺五加皂苷對Aβ25-35誘導PC12細胞的細胞毒性和細胞凋亡的有較好的保護作用[16]。刺五加提取液對半衰老模型小鼠學習記憶能力減退及腦組織MDA 、SOD、膽堿酯酶(TchE)、單胺氧化酶(MAO)活性變化有較好的保護作用[17,18]，提示刺五加可能的保護機制是其抗氧化作用。這些報道均提示刺五加對神經(jīng)變性疾病如老年性癡呆或帕金森病有保護作用。

APP是跨膜蛋白，APP經(jīng)過β-分泌酶和γ-分泌酶的作用下產(chǎn)生Aβ1-40或Aβ1-42，可以被a-分泌酶的作用下產(chǎn)生分泌型APP(SAPP)，最近報道也可以被ε-,δ-,η分泌酶的作用下產(chǎn)生不同的C-端片段[19]。此次研究我們就測定了γ-內(nèi)切酶的活性和Aβ1-40的含量以及APP-N端蛋白表達水平，今后我們想繼續(xù)對APP酶解相關的其他酶和相關基因進行更深層次研究，對β-分泌酶、α-分泌酶的活性以及各分泌酶的相關基因如PS1(γ-)、PS2(γ-)、BACE1(β-)、AMDM10(α-)的蛋白質(zhì)和mRNA水平的表達。綜上所述，刺五加皂苷對老年性癡呆有較好的保護作用，其保護作用的分子生物學機制可能是對APP酶解通路的干預作用，其更深的分子生物學機制有待于進一步研究和探討。

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EffectofAcanthopannxSenticoususSaponinsonprocessingPathwayofAmyloidprecursorprotein

LIUFang，LIJing-yang，QIUYe,etal.

(DepartmentofPreventiveMedicine,YanbianUniversityMedicalCollege,Yanji133002,China)

ObjectiveTo study the effects of Acanthopannx Senticousus Saponins(ASS) on processing pathway of amyloid precursor protein(APP).Methods(2015.9-2016.5)12.5 mg/L,25 mg/L,50 mg/L of ASS were treated to primary culturedrat cortical neuron cells， the activity of γ-secretase was measured by ELISA analysis;The APP695 gene was transfected into CHO cells using Lipper 2000 reagent.Stably transfected cells were sclected by G418(500 mg/L).12.5 mg/L,25 mg/L,50 mg/L of ASS were treated to stably transfected cellsfor 48 hours,ELISA assay was used to detected Aβ1-40concentration in the supernatant of cell culture medium.Western-blot analysis were used to detected the APP-N terminal fragment protein expression from cell lysate.ResultsIn the primary cultured cortical neuron cells,25 mg/L,50 mg/L ASS inhibited the activity of γ-secretase compared with control group,and,the effect of inhibition were enhanced as the concentration increased.The concentration of Aβ1-40was incresedand the expression of APP-N terminal fragment protein were decreased in APP695-CHO stably transfected cells,which all changes were alleviated by different dose of ASS.ConclusionASS could inhibit the activity of endogenousγ-secretase to decreasing Aβ1-40production and influence APP processing may have an protective effect on Alzheimer’s disease pathology.

Acanthopannx Senticousus Saponins；β-amyloid protein; γ-secretase; Alzheimer’s disease；APP-N terminal fragment

吉林省教育廳科學技術研究項目(吉教科合字2016-279號)

*通訊作者

1007-4287(2017)12-2173-04

R285

A

劉 芳(1990-)，女，碩士，研究方向為神經(jīng)毒理學;許妍姬(1973-)，女，博士，副教授，碩士生導師，研究方向為神經(jīng)毒理學。

2017-08-01)