CLC-3 siRNA對人肺動脈平滑肌細胞增殖及細胞周期的影響

師慶紅，秦 迪，趙長福，張 欣，楊照微，黃麗紅*，何成彥

(吉林大學中日聯誼醫院 1.檢驗科；2.老年病科；3.骨科，吉林 長春130033)

CLC-3 siRNA對人肺動脈平滑肌細胞增殖及細胞周期的影響

師慶紅1，秦 迪2，趙長福3，張 欣2，楊照微1，黃麗紅2*，何成彥1

(吉林大學中日聯誼醫院 1.檢驗科；2.老年病科；3.骨科，吉林 長春130033)

目的探討CLC-3 siRNA對人肺動脈平滑肌細胞(PASMC)增殖及細胞周期的影響。方法應用脂質體3000將CLC-3 siRNA轉入PASMC。通過免疫印記法測定了CLC-3 siRNA干擾后PASMC的CLC-3表達水平；應用臺盼藍染色計數法計數了細胞增殖；流式細胞儀測定了細胞周期。結果(1)CLC-3 siRNA可降低PASMC的CLC-3表達；(2)CLC-3 siRNA干擾可顯著抑制PASMC增殖,與空白對照、陰性對照 siRNA轉染組相比P<0.05；(3)CLC-3 siRNA干擾可顯著減少PASMC的S期細胞、增加G1期細胞，與空白對照、陰性對照 siRNA轉染組相比P<0.05。結論CLC-3 siRNA干擾PASMC表達CLC-3，可抑制PASMC的增殖并影響其細胞周期進程。

肺動脈高壓；肺動脈平滑肌細胞(PASMC)；氯離子通道CLC-3；siRNA

(ChinJLabDiagn,2017,21:2171)

肺動脈高壓嚴重威脅著人類健康[1]。研究證實肺小動脈血管增生是肺動脈高壓的主要特征之一，肺動脈血管平滑肌細胞(PASMC)增殖在肺動脈高壓的發生發展中起關鍵作用[2]。近年來以其為靶點治療肺動脈高壓取得一定進展。體內多種因素影響心肌及血管平滑肌細胞的增殖，如細胞腫脹激活性氯離子通道(Icl.swelling)及其氯通道CLC-3等[3,4]。在本研究中我們應用CLC-3 siRNA干擾人PASMC表達CLC-3蛋白，初步探討了干擾其表達對人PASMC增殖及其細胞周期的影響，為進一步深入研究CLC-3在肺動脈高壓發病機制中的作用及以其為靶點新的治療策略奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1人PAMSC的培養

人肺動脈平滑肌細胞(HPAMSC，ScienCell)培養于多聚賴氨酸處理(2 μg/cm2)的培養10 mm培養皿中，培養基為平滑肌細胞生長培養基(ScienCell)，其中含5%胎牛血清、SMCGS、青霉素、鏈霉素。5%二氧化碳培養箱中，生長至約90%匯合時傳代。HPAMSC在5至12代用于本實驗。

1.2CLC-3siRNA轉染

CLC-3 siRNA由Origene公司合成，序列為：AGCUACAACAGUAUAACAAGUGCAA，陰性對照siRNA由Origene公司提供。轉染方法：將分別用125 μl無血清SCM稀釋的7.5 μl Lipofectamin 3000 和1 μl CLC-3 siRNA(20 μM)混合，室溫孵育15 min，加入接種1×105HPAMSC 的6孔板中，輕輕混勻，培養48 h后進行干擾目的基因表達的檢測。

1.3免疫印記法檢測CLC-3蛋白表達水平

用細胞裂解液裂解細胞(Gengstar)，制備細胞總蛋白，BCA法測定蛋白含量。經10%SDS-PAGE電泳后轉膜，封閉過夜后加入CLC-3多克隆抗體(CST，1∶1 000稀釋)、GAPDH多克隆抗體(碧云天，1∶1 000稀釋)室溫孵育2 h，洗膜后加入HRP-羊抗兔IgG(碧云天1∶1 000稀釋)室溫孵育1 h，洗膜后加發光試劑(ThermoFisher)，壓片、顯影、定影后觀察記錄結果。

1.4細胞增殖的測定

轉染48 h后，用0.004%EDTA-0.05%胰酶消化細胞,PBS洗2次，用1%臺盼藍染色計數活細胞數，每組計數3孔。

1.5細胞周期測定

轉染48 h后，用0.02%EDTA-0.05%胰酶消化細胞,PBS洗2次后，用200 μl PBS重懸細胞，逐滴加入到預冷的70%乙醇中，4℃保存；24 h后離心，PBS洗3次，加入500 μl含50 mg/ml PI、100 μg/ml RNase A、0.2%Triton X-100的PBS，用流式細胞儀分析細胞周期。

1.6統計學分析

2 結果

2.1CLC-3siRNA對人PAMSC表達CLC-3蛋白的影響

空白對照、陰性對照 siRNA轉染及CLC-3 siRNA 轉染組細胞，提取細胞總蛋白，通過免疫印記法檢測CLC-3蛋白表達水平。結果顯示：與PAMSC空白對照、陰性對照 siRNA轉染組相比，CLC-3 siRNA組CLC-3表達水平降低，見圖1。

2.2干擾CLC-3表達對人PAMSC增殖及細胞周期的影響

轉染48 h后，收集空白對照、陰性對照 siRNA轉染及CLC-3 siRNA 轉染組細胞，計數每孔活細胞數并通過流式細胞儀進行細胞周期分析。結果顯示：與空白對照、陰性對照 siRNA轉染組相比，CLC-3 siRNA組活細胞數顯著減少(P<0.05)；CLC-3 siRNA組S期細胞呈減少、G1期細胞增加，與空白對照、陰性對照 siRNA轉染組相比，P<0.05，見表1。

表1 CLC-3 siRNA對人肺動脈平滑肌細胞增殖及細胞周期的影響

*與空白對照、陰性對照 siRNA組相比P<0.05

3 討論

肺動脈高壓是以肺小動脈血管痙攣、肺小動脈血管增生和重構為主要特征的一種疾病。PASMC增殖導致肺小動脈增生及重構，在肺動脈高壓病理過程中起關鍵作用[5]。目前針對PASMC增殖的藥物如前列腺環素類似物、內皮素受體拮抗劑等在臨床治療肺動脈高壓中取得了一定療效[6,7]，但療效仍不理想。近年來研究發現細胞腫脹激活性氯離子通道(Icl.swelling)及其通道基因CLC-3在高血壓、心肌缺血/再灌注、心肌肥厚和心力衰竭中發揮重要作用[8,9]。氯離子通道阻滯劑DIDS、DCPIB等可影響PASMC 的增殖，為開發肺動脈高壓治療策略指出了新的方向。在本研究中我們應用CLC-3 siRNA干擾人PASMC表達CLC-3蛋白，初步觀察到干擾CLC-3表達不僅可抑制人PASMC細胞增殖，而且也影響其細胞周期進程，使部分細胞阻滯在G1期，進入S期細胞顯著減少。本研究結果提示我們：CLC-3是研究PASMC增殖的較理想靶點，干擾CLC-3表達可影響PASMC細胞的 G1/S期轉換。本研究為深入探討CLC-3與肺動脈高壓相關性及CLC-3影響PASMC細胞增殖的機制奠定了實驗基礎。

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[2]張凌云,高安寶.肺動脈平滑肌細胞與低氧性肺血管重塑形成機制[J].中國動脈硬化雜志,2013,21(2)：177.

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[6]梁富翔，宋 兵，祁 泉,等.內皮素受體拮抗劑治療肺動脈高壓療效和耐受性的網狀Meta分析[J].中國循證心血管醫學雜志,2014,6(7)：663.

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CLC-3siRNAeffectsonHumanPulmonaryArterySmoothMuscleCellsProliferationandcellcycles

SHIQing-hong,QINDi,ZHAOChang-fu,etal.

(China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

ObjectiveTo evaluate the effects of CLC-3 siRNA on the proliferation and cell cycles of PASMC.MethodsWe transfect CLC-3 siRNA into PASMC by Lipofectamine 3000 reagent.The expression of CLC-3 protein in PASMC is detected by western blotting after CLC-3 siRNA transfection.The cell proliferation of PASMC is counting by trypan blue staining and the cell cycle of PASMC is analyzed by flow cytometry.Results(1)CLC-3 siRNA can reduce the expression of CLC-3 protein in PASMC.(2)CLC-3 siRNA interference can significantly decrease the proliferation of PASMC,compare to blank control,negative siRNA,P<0.05.(3)CLC-3 siRNA interference can significantly reduce the S phase PASMCs and increase G1 phase PASMCs,compare to blank control,negative siRNA ,P<0.05.ConclusionCLC-3 siRNA can interfere the CLC-3 expression in PASMC,and can decrease the proliferation of PASMC and affect the process of PASMC cell cycle.

Pulmonary hepertension；Pulmonary artery smooth muscel cells(PASMC)；Chloride channel CLC-3；siRNA

國家自然基金項目(81572082);吉林省科技廳資助(2015010153JC,20140311092YY)

*通訊作者

1007-4287(2017)12-2171-03

R543.2

A

2017-03-14)