慢性粒細(xì)胞白血病附加染色體異常分析

于波海,仁 實(shí),張 萌,柴 淼,蘇麗菊,貢鐵軍,于 鑫,騰 旭

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué) 生物學(xué)博士后流動(dòng)站，黑龍江 哈爾濱150081；2.哈爾濱市第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科，黑龍江 哈爾濱150010；3.哈爾濱市第一醫(yī)院 血研所，黑龍江 哈爾濱150010；4.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)部，遼寧 大連116001)

慢性粒細(xì)胞白血病附加染色體異常分析

于波海1,2,仁 實(shí)3,張 萌2,柴 淼2,蘇麗菊2,貢鐵軍3,于 鑫4,騰 旭1*

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué) 生物學(xué)博士后流動(dòng)站，黑龍江 哈爾濱150081；2.哈爾濱市第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科，黑龍江 哈爾濱150010；3.哈爾濱市第一醫(yī)院 血研所，黑龍江 哈爾濱150010；4.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)部，遼寧 大連116001)

目的分析17例Ph1陽性慢性粒細(xì)胞白血病患者附加染色體異常克隆演變特征。方法采用常規(guī)染色體G顯帶技術(shù)，回顧性分析17例慢性粒細(xì)胞白血病患者遺傳學(xué)資料。結(jié)果219例Ph1陽性CML患者，17例附加染色體異常發(fā)生率7.8%，其中慢性期10例(6.8%)，加速期3例(7.7%)，急變期4例(11.8%)。結(jié)論在CML診斷、治療及進(jìn)展過程中，傳統(tǒng)的染色體分析技術(shù)仍然是檢測(cè)ACAs的唯一方法，并提示可能的致病性、預(yù)后和療效。

慢性粒細(xì)胞白血病；附加染色體異常：核型分析

(ChinJLabDiagn,2017,21:2043)

慢性粒細(xì)胞白血病(Chronic myelogenous leukemia,CML) 是一類起源于多功能造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病。其診斷特征是9號(hào)染色體平衡易位至22號(hào)染色體，形成t (9;22) (q34;q11. 2 )，即費(fèi)城染色體(Philadelphia chromosome,Ph1)形成及BCR-ABL融合基因的產(chǎn)生[1]。根據(jù)其斷裂位點(diǎn)的不同可分為3種亞型：e13a2 (b2a2)、e14a2 (b3a2)和ela2，分別編碼 P210、P230和P190 蛋白，在白血病發(fā)生發(fā)展中起著極為重要的作用[2]。CML發(fā)生、發(fā)展過程存在三個(gè)階段：慢性期(chronic phase,CP) 、加速期(accelerated phase,AP) 以及急變期(blast crisis,BC) 。附加染色體異常(additional chromosome abnormalities,ACAs) 經(jīng)常出現(xiàn)在CML的發(fā)生、發(fā)展各個(gè)階段以及急性變過程中。大約有8%的Ph1染色體陽性的初診CML病例可觀察到附加染色體異常[3]。本研究，將我單位近十年間17例附加染色體異常CML患者遺傳學(xué)結(jié)果分析匯報(bào)如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

2006-2016年間我院接受治療的CML患者241例，其中17例患者Ph1+伴附加染色體異常，男性13 例；女性6例；中位年齡43歲；經(jīng)形態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)檢測(cè)，參照WHO(2001)標(biāo)準(zhǔn)診斷為CML并分期。臨床分期： 慢性期10 例；加速期3例；急變期4例。

1.2 方法

1.2.1染色體分析

全部病例均采集新鮮骨髓標(biāo)本直接法或不加植物血凝素的短期培養(yǎng)法，制備染色體標(biāo)本，然后采用姬姆薩G顯帶技術(shù)進(jìn)行核型分析，全部病例均分析20-40個(gè)中期分裂相。參照《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN)》的有關(guān)規(guī)定，分析染色體變異情況，并進(jìn)行照相、描述。

1.2.2BCR-ABL(P210)融合基因檢測(cè)

采集骨髓2 ml，肝素抗凝。將標(biāo)本沿管壁加到 Ficoll 分離液上層，兩者比例為1∶1 2 000 r/ min，室溫離心 20 min，吸取中間單個(gè)核細(xì)胞層，取 1 滴細(xì)胞混懸液計(jì)數(shù)后，收集約 106個(gè)細(xì)胞沉淀，-80℃?zhèn)溆谩０凑?Trizol (TaKaRa，中國) 說明書抽提 RNA。應(yīng)用7500型Q-PCR儀 (ABI，美國)。試劑來源于上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司的 BCR-ABL 融合基因定量檢測(cè)試劑盒(熒光 RT-PCR 法)，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。實(shí)驗(yàn)中同時(shí)對(duì) BCR-ABL P210參考品和內(nèi)參基因參考品進(jìn)行擴(kuò)增，分別獨(dú)立分析， 用獲得的相應(yīng)兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得到各標(biāo)本 BCR-ABL 的檢測(cè)濃度(A)和內(nèi)參基因的檢測(cè)濃度(B)。BCR-ABL 水平 = (A/B)×100%。

2 結(jié)果

2006-2016年間我單位門診及住院CML患者241例納入本研究，經(jīng)常規(guī)染色體G顯帶核型分析發(fā)現(xiàn)，219例患者Ph1染色體陽性，占 90.9% (219/241) ；17例Ph1染色體陽性患者伴有附加染色體異常，發(fā)生率7.8% (17/219)，男女比例11:6，中位年齡43 (21-65)歲；其中慢性期10例，加速期3例，急變期4例 (表1) 。

Ph1+伴ACAs可出現(xiàn)在CML各個(gè)階段，本研究中CML各階段ACAs發(fā)生率及主要核型異常見表2。

表1 17例Ph1+伴ACAs CML患者臨床特征

表2 CML各階段Ph1+伴ACAs發(fā)生率及主要核型異常

本研究應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)，比較17例患者BCR-ABL (P210) 融合基因表達(dá)水平，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，慢性期BCR-ABL水平顯著低于加速期與急變期。

表3 CML各階段Ph1+伴ACAs患者BCR-ABL(P210)融合基因表達(dá)水平

3 討論

自從1960年P(guān)h1首次被報(bào)道以來，其機(jī)制正在被大量的細(xì)胞遺傳性研究結(jié)果所揭示。關(guān)于CML常規(guī)染色體分析報(bào)道非常普遍，但是有關(guān)Ph1+伴ACAs的報(bào)道尚少見。本研究報(bào)道17例Ph1+伴ACAs的CML患者染色體異常克隆演變特點(diǎn)。

ACAs與CML疾病進(jìn)展密切相關(guān)，Ph1+伴ACAs意味著CML患者疾病侵襲性進(jìn)展的加速，傳統(tǒng)的染色體分析技術(shù)在CML診斷、治療及進(jìn)展中發(fā)揮的重要作用仍不能被分子生物學(xué)方法所替代。本研究中ACAs發(fā)生率隨著疾病的進(jìn)展不斷增高，預(yù)示ACAs在疾病預(yù)后中的作用機(jī)制可能更加復(fù)雜。意大利成人血液病工作小組關(guān)于CML前瞻性實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，Ph1+伴ACAs在CML患者細(xì)胞生成和分子應(yīng)答率明顯降低，且染色體異常的患者應(yīng)答時(shí)間明顯延長，附加染色體異常是使用伊馬替尼作為一線治療的慢性粒細(xì)胞白血病患者的一個(gè)不良預(yù)后因素[4]。據(jù)報(bào)道，附加染色體為非隨機(jī)性的，存在主要途徑(major-route)及次要途徑(minor-route)；主要途徑如：雙Ph1、+8、+9、i17等；次要途徑如：t(3;12)、t t(4;6)、t(1;21)、-Y、-17/+17、+21等。主要途徑ACA提示預(yù)后較差，臨床需要密切觀察、及時(shí)治療；次要途徑ACA與經(jīng)典的t(9;22) 預(yù)后未見明顯差異[5]。

近期研究結(jié)果顯示，雙Ph1、+8、+9、+19、+21、i17是ACA中常見的染色體異常，其中雙Ph1、+8及i17出現(xiàn)較為多見。+8、+9、+21易見于在髓系急性變 (myeloid-BC) 患者，而非淋系急性變 (lymphoid-BC) 患者；可能+8更具有急變趨勢(shì)的預(yù)測(cè)價(jià)值[6]。本研究中急變期患者僅4例，尚未觀察到這一現(xiàn)象，推測(cè)CML其它階段出現(xiàn)+8、+9、+21與急變期CML進(jìn)展趨勢(shì)相關(guān)。更有趣的是，超二倍體多發(fā)生于髓系急性變患者；亞二倍體多發(fā)生于淋系急性變患者，這與本研究中的3例急變期患者CML進(jìn)展趨勢(shì)非常一致。

多項(xiàng)研究證實(shí)，CML急變期伴有ACAs預(yù)后較差。急變期之前，出現(xiàn)17號(hào)染色體異常，提示預(yù)后不良；然而8號(hào)染色體異常所預(yù)示的預(yù)后價(jià)值目前還存在爭議。而眾所周知，21三體是唐氏綜合征(Down syndrome)的主要特征，本研究中4例CML患者存在21三體，且發(fā)生在CML不同階段，患者為成年或中老年，無智力異常及特殊面容，因此可以排除唐氏綜合征。-Y在正常的老年男性健康人群中也可以觀察到；因而本研究中-Y發(fā)生率有可能被高估；使用伊馬替尼治療的Y染色體缺失CML患者，細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)反應(yīng)及總生存明顯降低[7]。

本研究中17例患者BCR-ABL (P210) 融合基因檢測(cè)均為陽性，慢性期BCR-ABL (P210) 融合基因表達(dá)水平顯著低于加速期與急變期。研究認(rèn)為BCR-ABL陽性的 CML 患者存在多種類型的基因不穩(wěn)定性，如：染色體數(shù)量改變、假二倍體、DNA 缺失與嵌入等，從而導(dǎo)致了Ph1染色體以外的染色體改變。這些基因的變化是先于BCR-ABL融合基因發(fā)生還是由BCR-ABL融合基因引起？ 研究顯示基因不穩(wěn)定性在異常造血干細(xì)胞克隆內(nèi)先于Ph1染色體發(fā)生，而BCR-ABL融合基因進(jìn)一步促進(jìn)了遺傳不穩(wěn)定性[8]。

本研究中CML患者多半來自外省市，在病例追蹤過程中流失較大，因而本研究缺乏伊馬替尼治療后ACAs發(fā)生率的比較以及分析；未能計(jì)算經(jīng)歷完全細(xì)胞遺傳學(xué)緩解所需時(shí)間。本研究還將繼續(xù)，這樣會(huì)有更多的CML患者參與其中，在疾病的診斷、各階段以及伊馬替尼治療過程中，應(yīng)用分子生物學(xué)與細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，檢測(cè)ACAs發(fā)生與變化，進(jìn)一步揭示ACAs對(duì)CML致病以及預(yù)后的影響。

[1]Kurzrock R,Faderl S,Talpaz M,et al. The biology of chronic myeloid leukemia.[J]. New England Journal of Medicine,1999,341(3):164.

[2]Lee J,Kim D S,Lee H S,et al. Concurrence of e1a2 and e19a2 BCR-ABL1 Fusion Transcripts in a Typical Case of Chronic Myeloid Leukemia[J]. Annals of Laboratory Medicine,2017,37(1):74.

[3]Zaccaria A,Testoni N,Valenti A M,et al. Chromosome abnormalities additional to the Philadelphia chromosome at the diagnosis of chronic myelogenous leukemia:pathogenetic and prognostic implications[J]. Cancer Genetics & Cytogenetics,2010,199(2):76.

[4]Luatti S,Castagnetti F,Marzocchi G,et al. Additional chromosomal abnormalities in Philadelphia-positive clone:adverse prognostic influence on frontline imatinib therapy:a GIMEMA Working Party on CML analysis[J]. Blood,2012,120(4):761.

[5]Fabarius A,Leitner A,Hochhaus A,et al. Impact of additional cytogenetic aberrations at diagnosis on prognosis of CML:long-term observation of 1151 patients from the randomized CML Study IV[J]. Blood,2011,118(26):6760.

[6]Mu Q,Ma Q,Wang Y,et al. Cytogenetic profile of 1,863 Ph/BCR-ABL-positive chronic myelogenous leukemia patients from the Chinese population[J]. Annals of Hematology,2012,91(7):1065.

[7]Fabarius A,Leitner A,Hochhaus A,et al. Impact of additional cytogenetic aberrations at diagnosis on prognosis of CML:long-term observation of 1151 patients from the randomized CML Study IV[J]. Blood,2011,118(26):6760.

[8]Muvarak N,Nagaria P,Rassool F V. Genomic instability in chronic myeloid leukemia:targets for therapy?[J]. Current Hematologic Malignancy Reports,2012,7(2):94.

AnalysisofadditionalchromosomalabnormalitiesinPhiladelphia-positivecellswithchronicmyeloidleukemia

YUBo-hai1,2,RENShi3,ZHANGMeng2,etal.

(1.BiologyPost-doctorStation,HarbinMedicalUniversity,Harbin150081,China;2.DepartmentofLaboratoryMedicine,TheFirstHospitalofHarbin,Harbin150010,China;3.InstituteofHematologyandOncology,TheFirstHospitalofHarbin,Harbin150010,China;4.DepartmentofLaboratoryMedicine,AffiliatedZhongshanHospitalofDalianUniversity,Dalian116001,China)

ObjectiveTo investigate the clonal evolution of additional chromosomal abnormalities (ACAs) in Philadelphia-positive cells with chronic myeloid leukemia (CML).MethodsChromosome banding analysis was performed on bone marrow cells after 24 h short-term culture,and using conventional G-banding technique.Results219 patients were enrolled and ACAs occurred in 17 patients(7.8%),6.8% in chronic phase,7.7% in accelerated phase,and 11.8% in blast crisis (BC).ConclusionPerforming classic cytogenetics,both at diagnosis and during the course of the disease,is still the only way to detect the presence of and/or the development of ACAs,along with the possible pathogenetic,prognostic,and therapeutic implications.

Chronic myelogenous leukemia;Additional chromosome abnormalities;Karyotypic analysis

哈爾濱市科學(xué)技術(shù)局青年后備人才項(xiàng)目(No.2013RFQYJ081) 大連市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研項(xiàng)目(No.1611115)

*通訊作者

1007-4287(2017)12-2043-04

R733

A

于波海(1973-)，男，主任檢驗(yàn)技師，博士，從事實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)、病原生物學(xué)研究。

2017-02-08)