飛龍掌血提取物對高脂血癥心肌缺血小鼠氧化 損傷的影響

劉 明，鄧 穎，劉 楊，陳 運

(1.貴陽中醫學院基礎醫學院，貴陽 550025； 2.國家苗藥工程技術研究中心，貴陽 550002)

飛龍掌血提取物對高脂血癥心肌缺血小鼠氧化 損傷的影響

劉 明1,2，鄧 穎1，劉 楊1，陳 運1

(1.貴陽中醫學院基礎醫學院，貴陽 550025； 2.國家苗藥工程技術研究中心，貴陽 550002)

研究報告

目的觀察飛龍掌血提取物(Toddaliaasiaticaextract，TAE)對高脂血癥心肌缺血小鼠氧化損傷的影響，初步探討TAE對心血管保護作用的機制。方法選用雄性KM小鼠，隨機分成對照組、模型組、辛伐他汀組、TAE高、低劑量組，除對照組外，其余各組均用牛奶代替水自由飲用，誘導高脂血癥。同時灌胃給予相應的藥物，每天一次，連續28 d。于試驗結束72 h前分3次皮下注射鹽酸異丙腎上腺素(isoprenaline hydrochloride，Iso)，造成心肌缺血模型。檢測小鼠體重、心電圖、心臟和肝臟指數、心肌含水量、血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase，GPx)活性。結果TAE可改善模型小鼠心肌缺血心電圖變化，降低體重，抑制心臟、肝臟指數，降低心肌含水量；降低血清TC、TG、LDL-C含量，升高血清HDL-C含量；降低血清MDA含量，升高血清SOD、GPx活性。結論TAE可能通過調節氧自由基代謝，改善氧化損傷，發揮其保護心血管的作用。

飛龍掌血；高脂血癥；心肌缺血；氧化損傷

盡管醫學領域取得了長足的發展，但心血管疾病仍然是世界范圍內導致死亡的主要原因之一，每年大約有1800萬人死于心血管疾病[1]。動脈粥樣硬化是心血管疾病的根本原因，脂質代謝異常是動脈粥樣硬化最重要的危害因素[2]。大量研究表明，脂質過氧化參與心血管疾病從發生到發展以及惡化的全過程，調控氧自由基代謝是心血管疾病治療的一種可靠、有效的手段[3,4]。

飛龍掌血為蕓香科植物飛龍掌血ToddaliaasiaticaLam.的根或根皮，為貴州苗族習用藥材[5]。藥理研究表明其具有抗炎、鎮痛、抗氧化、抗病毒、保護心肌等作用[6,7]。因此，飛龍掌血顯示潛在的對心血管疾病的治療作用。本研究利用牛奶誘導高脂血癥及異丙腎上腺素誘導心肌缺血小鼠模型，探討飛龍掌血是否通過調節氧自由基代謝、降血脂等環節，實現對心血管系統的保護作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級KM小鼠，雄性，體重(20±2)g，50只，購自中國人民解放軍第三軍醫大學實驗動物中心[SCXK-(軍)2014-0011]。動物飼養于貴州省實驗動物工程技術中心[SYXK(黔)2012-0001]，飼養環境：溫度(25±2)℃和濕度(55±2)%，自由進食，每日光照/黑暗各12 h。并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2 實驗藥物和試劑

飛龍掌血提取物(TAE)是由飛龍掌血根皮提取獲得(飛龍掌血根皮購自貴陽市藥材市場，加8倍70%乙醇回流提取2次，濾液經水沉淀后，濃縮干燥，提取率為10%)，臨床人日用生藥量為10～30 g，本研究依據預實驗結果擬定人日用生藥量為12 g，折算為提取物為1.2 g；辛伐他汀片(每片10 mg)，山東魯抗醫藥集團賽特有限責任公司；鹽酸異丙腎上腺素注射液(1 mg/mL)，上海禾豐制藥有限公司；TC、TG、LDL、HDL、SOD、MDA、GPx試劑盒，南京建成生物工程研究所；山花純牛奶(每袋200 mL)，貴陽三聯乳業有限公司。

1.3 實驗儀器

MS-200生物信號記錄儀，成都泰盟科技有限公司；TGL-12 GB-C臺式高速離心機，上海安亭科學儀器廠；FA3204電子分析天平，上海良平儀器儀表有限公司；721分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；ZS-3型酶標儀，北京新風機電廠。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組、給藥及高脂血癥模型制備

將50只小鼠隨機分成對照組(control)、模型組(model)、辛伐他汀組(SVTT，5 mg/kg)、飛龍掌血提取物高、低劑量組(TAE，400、100 mg/kg)，每組10只，灌胃給予相應的藥物，20 mL/kg，每天一次，連續28 d，對照組和模型組灌胃等容積生理鹽水。同時，參照文獻方法[8]制備高脂血癥模型：除對照組外，其余各組小鼠每天以牛奶代替水飲用(在飲水瓶中加入足量牛奶，每天更換新鮮牛奶)，各組均以基礎飼料喂養，自由進食。

1.4.2 小鼠冠狀動脈痙攣性心肌缺血的誘導

參照文獻方法[9]造模：于末次給藥前72 h，除空白對照組外，于灌胃給藥30 min后，各組動物皮下注射Iso 20 mg/kg，對照組給予等容量的生理鹽水，連續3次，每間隔24 h，誘發冠狀動脈痙攣心肌缺血。

1.4.3 觀察指標及檢測

第3次皮下注射Iso前，小鼠用20%烏拉坦(7.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，與MS-200生物信號記錄儀相連，先描記一段注射Iso前的心電圖，然后皮下注射Iso，記錄30 min的II導聯心電圖。主要觀察陽性標準T波和ST段，參照文獻標準[10]，具備以下條件之一者即可判斷為心肌缺血陽性，①心電圖ST段水平上抬或向下偏移>0.1 mV；②T波高聳超過同導聯R波的1/2及以上者。每間隔10 min記錄一次小鼠II導聯心電圖，共記錄30 min，分別測量Ⅱ導聯在各時刻ST段偏移的幅度，計算各組Ⅱ導聯注射Iso前與注射Iso后各時刻ST段偏移幅度的差值△ST。

上述檢測完成后，心臟取血，3500 r/min離心15 min，取上清液，按照試劑盒說明書操作，檢測血清TC、TG、LDL、HDL、SOD、MDA、GPx含量。

取心臟、肝臟，用實際分度值為0.1 mg的電子分析天平精密稱重，計算臟器指數。臟器指數=臟器重÷體重×100%。

將心臟置于烘箱中80℃烘干，取出精密稱重，計算心肌含水量。心肌含水量=(心臟濕重-心臟干重)÷心臟濕重×100%。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 體重、臟器指數及心肌含水量的變化

結果顯示模型組小鼠體重明顯增加，心臟和肝臟指數、心肌含水量顯著升高；與模型組相比，TAE高劑量組能顯著降低小鼠心臟指數，TAE高、低劑量組均能明顯降低小鼠體重、肝臟指數和心肌含水量(P< 0.01，P< 0.05)。如表1所示。

2.2 心電圖變化

模型組小鼠S-T段缺血改變明顯，各時刻ST段偏移幅度的差值顯著增加；與模型組相比，TAE高、低劑量組均能明顯改善小鼠心肌缺血變化，各時刻ST段偏移幅度的差值顯著下降(P< 0.01，P< 0.05)。如表2、圖1所示。

2.3 血清血脂水平的變化

模型組小鼠血清TC、TG、LDL含量顯著升高，血清HDL含量明顯降低；與模型組相比，TAE高劑量組能顯著降低小鼠血清LDL含量，TAE高、低劑量組均能顯著降低血清TC、TG含量并升高血清HDL含量(P< 0.01，P< 0.05)。如表3所示。

2.4 血清SOD、MDA、GPx水平的變化

模型組小鼠血清SOD、GPx含量明顯降低，MDA含量顯著升高；與模型組相比，TAE高、低劑量組均能顯著降低血清MDA含量，升高SOD、GPx含量(P< 0.01，P< 0.05)。如圖2所示。

表1 對模型小鼠體重和臟器指數的影響Tab.1 Effects of TAE on the body weight, heart and liver indexes of the model mice

注：與模型組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。表2、3、4同。

Note.Compared with the model group，*P< 0.05，**P< 0.01. The same as in Tab. 2, 3, 4.

表2 對模型小鼠心電圖的影響Tab.2 Effects of TAE on electrocardiogram of the model mice

圖1 對模型小鼠心電圖的影響Fig.1 Effects of TAE on electrocardiogram of the model mice表3 對模型小鼠血清TC，TG，LDL，HDL含量的影響Tab.3 Effects of TAE on the serum contents of TC，TG，LDL and HDL of the model mice

組別Groups劑量/mg/kgDosesTCTGLDLHDL對照組Controlgrouo—087±016?058±018??056±016??046±017?模型組Modelgroup—104±016088±019080±014030±011辛伐他汀組SVTTgroup5089±015?070±018?062±015?041±014?飛龍掌血組400086±023?071±021?067±015?043±018?TAEgroup100083±017?066±017?070±021044±016?

注：與模型組相比，* P< 0.05，** P< 0.01。圖2 對模型小鼠血清SOD、MDA、GPx水平的影響Note.Compared with the model group，* P< 0.05，** P< 0.01.Fig.2 Effects of TAE on the levels of serum SOD, MDA and GPx of the model mice.

3 討論

引起高脂血癥的原因很多，其中最常用的是給動物喂飼高脂飼料或高脂乳劑，但因飼料過于油膩、膽鹽具有苦味等而影響動物的進食，動物的體重并無明顯增長，不能形成肥胖癥；且在不同時間點內動物血脂檢測TC、TG、HDL、LDL的差異較大[11]；且油脂對整個實驗環境也造成一定的污染。吳爭榮等[8]用牛奶喂養小鼠，成功建立了高脂血癥動物模型。該方法與常用的高脂血癥造模方法相比，投入成本相對較少，又避免了室內由于高脂飼料導致氣味難聞等缺點，造模比較簡單、經濟、有效，且小鼠在比較自然的條件下造模，所以更加符合人類高脂血癥的形成特點。本研究結果表明，給小鼠飲用牛奶，可使小鼠的進食量明顯增加，牛奶和飲食量過多，導致體內脂肪蛋白過剩，進而引起體內脂肪累積，引起高脂血癥，造成模型組小鼠的體重明顯增加，肝臟指數顯著升高，血清TC、TG、LDL含量顯著升高，血清HDL水平明顯下降。經飛龍掌血治療后，小鼠的體重明顯降低，肝臟指數顯著下降，血清TC、TG、LDL含量顯著降低，血清HDL水平明顯上升，表明飛龍掌血對牛奶引發的高脂血癥具有顯著的抑制作用。

近年研究發現，90%以上的缺血性心臟病是由于冠狀動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)引起的，高脂血癥是AS的重要促進因素[12]。高脂血癥本身引起的死亡并不多見，但高脂血癥由于脂質代謝紊亂、脂質過氧化、血液流變學異常等[13]，易引起AS、冠心病、高血壓、糖尿病等多種疾病，嚴重危害人類健康，因此高脂血癥及其引發的疾病的預防和治療已經成為目前的研究熱點。大量研究表明，高脂血癥造成機體脂質代謝紊亂的同時及心肌缺血時均會引起機體氧化與抗氧化平衡失調，即機體氧自由基產生增加而自由基相關清除酶活力下降[14,15]。SOD是體內清除氧自由基的關鍵酶，反映機體清除氧自由基的能力。MDA 是過氧化脂質氧化分解的產物，對細胞膜及細胞功能具有一定的損傷作用，同時干擾脂肪酸的氧化降解。GPx 是一種重要的過氧化物分解酶，抑制脂質過氧化反應對細胞的損傷。本研究結果顯示，飛龍掌血對高脂血癥心肌缺血小鼠心肌具有保護作用，表現為小鼠心臟指數顯著降低、心肌含水量下降，明顯改善心電圖S-T段，降低血清MDA含量，升高血清SOD、GPx水平，說明飛龍掌血通過增加高脂血癥心肌缺血小鼠的心肌抗氧化能力和減少氧自由基的產生，以減少細胞損傷，保護心肌細胞。

本研究對飛龍掌血提取物降血脂、抗心肌缺血和抗氧化的作用機制做了初步的探討，發現飛龍掌血提取物可有效降低高血脂和改善心肌缺血損傷，改善脂質代謝紊亂和脂質過氧化，為進一步開發利用飛龍掌血植物資源和研制新藥提供了實驗依據和理論基礎。

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ProtectiveeffectsofToddaliaasiaticaextractonoxidativedamagesinmicewithmyocardialischemiaandhyperlipidemia

LIU Ming1,2， DENG Ying1， LIU Yang1， CHEN Yun1

(1.Basic Medical School，Guiyang College of Chinese Medicine，Guiyang 550025，China; 2.National Engineering and Technological Research Center of Miao Medicine，Guiyang 550002)

ObjectiveTo explore the effects ofToddaliaasiaticaextract(TAE)on oxidative damages in mice with myocardial ischemia and hyperlipidemia.MethodsFifty SPF male KM mice were randomly divided into 5 groups：control group，model group，simvastatin group (5 mg/kg)，high-dose TAE group (400 mg/kg) and low-dose TAE group (100 mg/kg). Hyperlipidemia was induced by feeding milk for 4 weeks. At the same time，the corresponding drug was given by oral administration with 20 mL/kg for 28 d. At the end of four-week treatment, isoprenaline hydrochloride (Iso) was subcutaneously injected every 24 hours for three times. The body weight, electrocardiogram, heart and liver indexes, myocardial water content, and the serum levels of TC, TG, HDL, LDL, SOD, MDA and GPx were measured.ResultsTAE significantly improved the electrocardiogram changes induced by Iso and milk in the mice, weight lose, inhibited the heart and liver indexes, reduced the myocardial water content, decreased the levels of TC, TG, LDL and MDA, and increased the contents of HDL, SOD and GPx.ConclusionsTAE may play an important role in cardiovascular protection by regulating oxygen free radical metabolism and improving oxidative damages.

Toddaliaasiatica; Hyperlipidemia; Myocardial ischemia; Oxidative damages

貴州省科學技術基金(黔科合J字[2012]2087號)；貴陽中醫學院博士基金(2011年)；貴州省科技計劃項目(黔科合院士站[2014]4013號)。

劉明(1981-)，男，博士，副教授，研究方向：中藥、民族藥防治心腦血管疾病藥理研究。E-mail： 393617518@qq.com

R-33

A

1671-7856(2017) 12-0051-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.12.009

2017-05-24