低溫低壓環境對小鼠褐色脂肪組織形成的影響

仝永娟，楊 朵，李 娜，束 華，馬 剛，高娜娜，張國英，張曉迪

(1.首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院實驗動物中心，北京 100038； 2.中國科學院昆明動物研究所靈長類研究 中心，昆明 650223)

低溫低壓環境對小鼠褐色脂肪組織形成的影響

仝永娟1，楊 朵1，李 娜1，束 華1，馬 剛1，高娜娜1，張國英1，張曉迪2

(1.首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院實驗動物中心，北京 100038； 2.中國科學院昆明動物研究所靈長類研究 中心，昆明 650223)

研究報告

目的探索低溫低壓環境對小鼠褐色脂肪組織的影響。方法選取個體健康均一的6周齡成年雄性C57BL/6 N小鼠24只，平均分為4組，每組6只鼠，分別飼養在常溫常壓(18～22℃、海拔20～60 m)、常溫低壓(18～22℃、海拔5000 m)、常壓低溫(0～6℃、海拔20～60 m)、低溫低壓(0～6℃、海拔5000 m)的環境中。實驗周期為4周，在試驗開始和結束時分別測量每只小鼠的體重，在實驗結束后完整取下試驗小鼠背部及腹股溝脂肪，并對背部及腹股溝脂肪組織進行HE染色，對背部脂肪的褐色脂肪的標志物UCP-1進行qPCR分子表達及western blot蛋白表達的測定。結果低溫低壓、低溫常壓和常溫低壓組小鼠的體重增加量顯著低于同期正常對照組小鼠；低溫低壓、低溫常壓小鼠背部和腹股溝脂肪組織顏色較深，血運豐富，常溫常壓組的脂肪組織形態較其他組偏大；染色結果顯示小鼠背部脂肪細胞充盈多個脂肪泡，細胞較小，顏色較深，形態上是典型的褐色脂肪細胞；在低溫條件下，小鼠背部脂肪組織的褐色脂肪標志物UCP-1在mRNA和蛋白水平上高表達，低壓條件下僅在mRNA的水平上有上調。結論模擬高原環境的低溫低壓條件對小鼠褐色脂肪組織的形成有刺激作用，這種作用更多的與溫度的降低有關。

低壓低氧；褐色脂肪組織；解偶聯蛋白

哺乳動物體內的脂肪可根據不同的功能分為：白色脂肪(white adipose tissue，WAT)、米色脂肪細胞(brown-in-white)和褐色脂肪組織(brown adipose tissue，BAT)。褐色脂肪細胞來源于間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，一部分是由脂肪前體細胞分化而來，另一部分是由成肌細胞在特定條件下分化而來，起初，人們認為褐色脂肪組織進僅存在于哺乳動物的嬰幼兒時期，后來，大量學者通過活檢分析發現成年人也有褐色脂肪組織，主要分布于肩胛間、脊椎周圍、腋下、會陰等部位[1,2]。

褐色脂肪能夠通過氧化磷酸化解偶聯，促使體內儲能的白色脂肪分解產熱和消耗能量[3,4]，維持機體溫度恒定，影響能量代謝率[5]。很多研究發現，低溫條件下刺激小鼠能夠使其褐色脂肪組織含量顯著增加以維持體溫[6-8]。Toselli等[9]在測量了居住于海拔3600 m的秘魯安第斯山脈的蓋丘亞族人和海拔3200 m的吉爾吉斯人的體脂百分比后發現，高海拔條件下，肥胖人口數量較低。那么高原環境對褐色脂肪的形成是否有直接的影響，其中的影響機制是什么，目前還鮮有報道。本實驗在動物試驗負壓艙中，對低壓低溫環境條件下小鼠體重及褐色脂肪的形成情況進行了研究，通過對脂肪組織HE染色切片的觀察，及對褐色脂肪組織標志物解偶聯蛋白(uncoupling protein 1, UCP-1) 的分子和蛋白表達量的檢測來研究低壓低溫條件對小鼠背部褐色脂肪組織形成的影響。旨在探索高原環境下褐色脂肪組織的變化情況極其相關機制，為高原條件下脂肪代謝的研究提供重要的理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性C57BL/6 J小鼠24只，6周齡，體重(20±1.5)g。購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2016-0011]。飼養于首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院動物實驗室[SYXK(京)2013-0003]。并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2 實驗分組

小鼠隨機分為4組，每組6只鼠，分別為：常溫常壓組(normal atmospheric pressure and temperature group，NTNP),常溫低壓組(low atmospheric pressure and normal temperature group，NTLP)、低溫常壓組(normal atmospheric pressure and cold exposure group，LTNP)、低溫低壓組(low atmospheric pressure and cold exposure group，LTLP)(其中，常溫為25℃室溫，常壓為北京平原地區海拔20～60 m，低溫為0～6℃ 低溫泡沫保溫盒，低壓為模擬海拔5000 m動物試驗負壓艙)。

1.3 主要試劑與儀器

脂肪固定液(Leagene)；HE染色試劑盒(Leagene)；Trizol(Invitrogen)；氯仿(北京化工廠)；乙醇(北京化工廠)；異丙醇(北京化工廠)；cDNA第一鏈合成試劑盒(康為世紀)；UltraSYBR Mixture(康為世紀)；蛋白裂解液(普利萊)；CBA蛋白定量試劑盒(普利萊)；蛋白凝膠試劑盒(普利萊)；抗體[(一抗、二抗、內參)abcam]。

分析天平(Mettler)；熒光定量PCR儀(ThermoFisher)；全波長化學發光儀(Tecan Spark)；電泳儀(Bio-Rad)；攤片機(科迪KD-P)；切片機(科迪KD-2258)；顯微鏡(Nikon)；動物試驗負壓艙(淮坊華信)。

1.4 負壓艙參數

試驗使用的低壓低氧艙由濰坊華信氧業公司生產(DSF-Ⅱ動物實驗負壓艙)，負壓艙為橫臥式全封閉不銹鋼結構，設備容積為740 L，負壓艙設置為(5000±100)m。

1.5 實驗方法

1.5.1 小鼠體重的測量

在實驗第1天小鼠進入低壓氧艙前，稱取每只小鼠的體重，在第28天實驗結束后稱取每只小鼠的體重。

1.5.2 小鼠背部及腹股溝脂肪組織樣本的收集

采用10%水合氯醛麻醉后脫頸處死小鼠，解剖暴露小鼠背部及腹股溝脂肪并完整取下，拍照后取各組小鼠背部及腹股溝脂肪的相同部位保存于Leagene脂肪組織固定液，用于HE染色，將背部脂肪組織保存于液氮，分別用于RNA的提取，蛋白的裂解。

1.5.3 各組不同部位脂肪組織RNA的提取及cDNA文庫的建立

取各組脂肪組織100 mg，分別加入1 mL Trizol于組織研磨器中充分研磨后移入1.5 mL離心管，室溫靜置5 min，加入0.2 mL氯仿，充分混勻后靜置5 min；12 000 r/min離心15 min，小心將上層水相移入新1.5 mL離心管內，再加入等體積的異丙醇，充分混勻后靜置5 min；12 000 r/min離心15 min，小心去掉上清液，用75%酒精(DEPC水稀釋)充分洗滌2遍，即得到抽提的RNA樣品。然后按照說明書，用cDNA逆轉錄試劑盒進行文庫的建立。

1.5.4 相關基因的檢測

以GAPDH為內參，按照試劑盒說明書，對UCP-1進行相關基因表達的檢測，引物設計[8]見表1。

表1 小鼠GAPDH、UCP-1引物序列Tab.1 Primer sequences of the mouse GAPDH and UCP-1

1.5.5 相關蛋白的抽提及western bolt檢測

從液氮中取出組織放入研缽內，在研缽中加入液氮，充分研磨組織，快速轉移至1.5 mL離心管，加入RIPA裂解液(含1%PMSF)1 mL，離心后取上清。用CBA法測蛋白濃度后加入loading buffer，煮沸5 min使其變性，用12%分離膠和5%濃縮膠的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，待條帶跑開后轉膜，用5% TBST牛奶封閉1 h，分別加入內參和UCP-1的一抗進行孵育，TBS充分洗滌后再加入二抗進行孵育，TBS充分洗滌后上機檢測。

1.5.6 組織石蠟切片的制備及HE染色

從固定液中取各組適當大小的固定好的脂肪塊，參照文獻[10]進行脫水和浸蠟，包埋于石蠟塊中。將做好的石蠟塊用切片機切片至適當的位置，于攤片機中攤片于載玻片上，烤片后按照說明書進行HE染色，于顯微鏡下觀察拍片。

1.6 統計學方法

實驗結果使用JMP 10.0(SAS Institute, Inc, Cary, NC)統計軟件，采用單因素方差分析，通過least-significant-difference(LSD)最小顯著性差異法，進行兩兩比較，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 低溫低壓對小鼠體重的影響

低溫低壓環境對小鼠體重的影響結果如圖1所示，結果顯示正常組小鼠體重平均增加4.35 g，常溫低壓組和低溫低壓組小鼠體重分別平均增加1.72 g和1.27 g，而低溫常壓組小鼠的體重略有下降，平均降低了0.38 g。圖1中結果表明在常溫低壓，低溫常壓和低溫低壓的條件下，小鼠的體重增加量顯著低于在常溫常壓條件下的增加量。

注：與常溫常壓組比較，* P< 0.05。圖1 小鼠第四周實驗結束后體重增重情況Note.Compared with the normal atmospheric pressure and temperature group,* P< 0.05.Fig.1 Body weight gains in the mice of different groups

圖2 不同組別小鼠的背部及腹股溝脂肪Fig.2 The groin and back adipose tissues from different groups of mice

2.2 低溫低壓對小鼠脂肪組織及切片的影響

圖3 不同組別小鼠腹股溝及背部脂肪HE染色切片(Bar=20 μm)Fig.3 Histology of groin and back adipose tissues of the mice.

各處理組小鼠的背部及腹股溝的脂肪形態如圖2所示，低溫低壓及低溫常壓組小鼠的背部及腹股溝脂肪顏色較深，血運豐富，常溫常壓及常溫低壓組并未有明顯差別，常溫常壓組的脂肪組織形態較其他組偏大。不同處理組小鼠背部及腹股溝脂肪組織切片形態呈相如圖3所示(40倍物鏡)，可以看出，腹股溝脂肪細胞體積較大，細胞內部脂滴空泡較少且體積較大，顏色較淺，背部脂肪細胞體積較小，細胞內部脂滴空泡較多，體積也較小，顏色較深，說明褐色脂肪組織主要存在于小鼠背部的脂肪中。

2.3 低溫低壓對小鼠背部褐色脂肪基因表達的影響

在四周的實驗周期結束后，各處理組小鼠背部脂肪的UCP-1在mRNA水平上的表達結果如圖4所示。結果顯示，小鼠在低溫條件下UCP-1表達量顯著上調，在低壓條件下UCP-1的表達量也顯著上調，但UCP-1表達量的上調在低壓條件下沒有低溫條件下的大。

注：與常溫常壓組比較，* P< 0.05圖4 不同組別小鼠背部脂肪UCP-1的mRNA表達結果Note.Compared with the normal atmospheric pressure and temperature group,* P< 0.05.Fig.4 UCP-1 expression in the back adipose tissue of mice from different groups

2.4 低溫低壓對小鼠背部褐色脂肪UCP-1蛋白質表達的影響

在四周的實驗周期結束后，小鼠背部脂肪在蛋白水平上表達結果如圖5所示。結果顯示，常溫常壓和常溫低壓條件下UCP-1的蛋白表達量較低，而低溫常壓和低溫低壓條件下UCP-1的蛋白表達量高。

圖5 不同組別小鼠背部脂肪UCP-1的蛋白表達結果Fig.5 The UCP-1 expression of back adipose tissue in the mice from different groups

3 討論

有研究發現，褐色脂肪組織中含有β3腎上腺素受體[11]，能夠在解偶聯代謝的過程中調節脂肪分解[12]，提高非顫栗性產熱，從而減少脂肪的堆積，降低體重，起到抗肥胖的作用[13,14]。本研究結果發現，褐色脂肪組織含量較高的低溫低壓以及低溫常壓組小鼠的體重增加量低于同時期常溫常壓組(圖2)，脂肪組織的形態也小于同時期常溫常壓組(圖1)，與上述研究結果一致，而常溫低壓組的體重增加量也低于常溫常壓組，這可能與低壓條件下小鼠易形成肺動脈高壓有關[15]。

UCP1、PRDM16、PGC-1、CIDEA、Deiodinase typeⅡ等的表達是褐色脂肪細胞形成的標志[16,17]，其中最主要的標志物是UCP-1。有研究發現，寒冷環境刺激中樞神經系統，并通過β-腎上腺素能通路，增加產熱活動，這個過程也與褐色脂肪組織有密不可分的關系。冷暴露和β-腎上腺激素等刺激能夠直接或者間接的通過影響miR-133、miR-155、miR-196 a 和 miR-193b-365等mircoRNA的表達起到調節褐色脂肪組織的形成的作用[18]。本試驗中低溫組的褐色脂肪組織標志物UCP-1在分子水平和蛋白水平上的表達均顯著高于同條件下的常溫組，與上述研究的結論一致，說明低溫冷暴露可以直接刺激褐色脂肪組織形成。

低氧可以直接或者輔助其他刺激因素調節notch、cox-2、Wnt等多種信號通路[19-21]，其中有些信號通路與褐色脂肪組織的形成也密切相關，如影響細胞增殖分化的Wnt信號通路[22]，低氧條件下神經干細胞中Wnt/β-catenin信號通路的相關分子β-catenin的表達明顯高于常氧條件下[21]。又有研究發現激發wnt10b通路能夠抑制褐色脂肪的形成[23]。Kang等[24]則在實驗中發現，Wnt/β-catenin通路高表達能夠抑制脂肪組織的形成。本試驗結果中，低溫低壓組別的小鼠，褐色脂肪組織的形成與低溫常壓組并無明顯差別，僅在mRNA的水平上有顯著降低的趨勢。低壓條件是否對褐色脂肪組織形成過程中的某個信號通路有影響，仍需進一步的探討研究與探索。

本研究結果表明，在壓力相同的情況下，低溫環境與常溫環境相比，能抑制褐色脂肪組織的形成，而在溫度相同的情況下，低壓環境對褐色脂肪組織的形成是否有影響還有待進一步的研究與探索。本研究為今后進一步研究低溫低壓條件對棕色脂肪細胞形成的影響提供了研究基礎，也為今后高原環境下脂肪代謝的相關研究提供了理論依據。

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Effectofhypobarichypoxiaandcoldexposureonformationofbrownadiposetissueinmice

TONG Yong-juan1， YANG Duo1， LI Na1， SHU Hua1， MA Gang1， GAO Na-na1， ZHANG Guo-ying1， ZHANG Xiao-di2

(1.Depantment of Laboratory Animal Center, Beijing Shijitan Hospital. CMU, Beijing 100038, China； 2.Kunming Institute of Zoology. CAS, Kunming 650223)

ObjectiveTo investigate the effect of hypobaric hypoxia and cold exposure on brown adipose tissue in mice.MethodsTwenty-four 6-week old SPF C57BL/6 male mice were randomly divided into 4 groups with 6 mice in each group: normal atmospheric pressure and temperature group (18～22℃, 20～60 m)(NTNP), low atmospheric pressure and normal temperature group(18～22℃, altitude of 5000 m)(NTLP), normal atmospheric pressure and cold exposure group(0～6℃, altitude of 20～60 m)(LTNP), low atmospheric pressure and cold exposure group(0～6℃, altitude of 5,000 m)(LTLP). The experimental period was 4 weeks. The body weight was measured at the beginning and end of the experiment. By the end of the four-week trial, the back and inguinal fat were dissected and observed by histology using HE staining. The expression of UCP-1 as the marker of brown adipose tissue in the back fat was detected by qPCR and western blot.ResultsThe body weight gain of NTNP group was higher (P< 0.05) than the other three groups. Meanwhile, the color of the back and groin fat tissue of mice of LTNP and LTLP groups were darker, the blood supply in mice of these two groups was richer than the NTLP group. The volume of adipose tissue of NTNP group was higher than others. The histology showed that the back adipose cells of the mice were smaller and darker and full of multilocular lipid droplets, exhibiting a typical morphology of brown fat cells. Compared with the NTNP and NTLP groups, the mRNA and protein levels of UCP-1 were higher under cold exposure, while low atmospheric pressure had a tendency to reduce the mRNA expression of UCP-1.ConclusionsThe formation of brown fat is affected by the imitated conditions of low atmospheric pressure and cold exposure, and is more closely related to the decresed temperature.

Cold exposure; Hypobaric hypoxia; Brown adipose tissue; UCP-1

2017-06-10

首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院院青年基金(2015-q15)；中國鐵路總公司科研項目(J2016Z031)。

仝永娟(1988-)，女，研究實習員。研究方向：實驗動物研究與應用。E-mail： tongyongjuan1020@163.com

R-33

A

1671-7856(2017) 12-0061-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.12.011

〔收稿日期〕2017-06-04