燕麥β-葡聚糖對膿毒癥小腸損傷相關基因表達的影響

吳昆鵬，陳 瑩，黃治家*，言彩紅

(1.南華大學附屬第二醫院，重癥醫學科，湖南 衡陽 421001； 2.南華大學附屬第二醫院，麻醉科，湖南 衡陽 421001)

燕麥β-葡聚糖對膿毒癥小腸損傷相關基因表達的影響

吳昆鵬1，陳 瑩2，黃治家1*，言彩紅1

(1.南華大學附屬第二醫院，重癥醫學科，湖南 衡陽 421001； 2.南華大學附屬第二醫院，麻醉科，湖南 衡陽 421001)

研究報告

目的探索燕麥β-葡聚糖對膿毒癥小腸損傷相關基因表達的影響。方法SD大鼠隨機分為正常對照組(NC組)，實驗對照組(TC組)，燕麥β-葡聚糖組(Oglu組)。TC組和Oglu組以盲腸結扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)法建立膿毒癥模型。Oglu組以不同劑量燕麥β-葡聚糖灌胃。12 h后收集各組小腸組織，Western blot檢測小腸組織損傷基因表達。結果1)燕麥β-葡聚糖減輕膿毒癥誘導的小腸損傷，降低膿毒癥大鼠小腸組織中TNF-α、IL-1β及IL-6水平(P< 0.05)；(2)膿毒癥組小腸損傷相關蛋白Bcl-2表達下調，Bax、caspase-3、Toll樣、凋亡基因FAS和FASL、NF-κB表達明顯增加；(3)燕麥β-葡聚糖組小腸粘膜Bax、caspase-3、Toll樣、凋亡基因FAS和FASL、NF-κB的表達低于明顯膿毒癥組，而Bcl-2表達較高。結論燕麥β-葡聚糖調控膿毒癥大鼠小腸損傷基因的表達，保護小腸上皮免受膿毒癥的損傷。

燕麥β-葡聚糖；膿毒癥；腸粘膜

目前認為腸道是膿毒癥發生發展的始動因素[1]，膿毒癥時造成腸黏膜上皮水腫，上皮細胞膜及細胞間連接斷裂，細胞壞死，上皮從絨毛頂端開始脫落，甚至黏膜全層脫落而形成潰瘍，造成腸道通透性增加、腸屏障功能受損，腸道細菌及其毒素得以吸收進入循環系統而發生細菌移位，使全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)加劇、失控，嚴重時誘發多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，甚至危及患者生命[2]。故腸功能的保護是膿毒癥治療中極為重要的論題。早在上世紀80年代，國外學者就發現燕麥和大麥中富含的水溶性β-葡聚糖對人體腸道的保護作用[3,4]，但主要強調營養膳食方面，對腸道基因影響方面的研究極少。為此，我們建立大鼠膿毒癥模型，研究燕麥β-葡聚糖對小腸損傷過程中基因表達的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

60只清潔級SD雄性大鼠，6～8周齡，體重280～320 g，由南華大學實驗動物部提供[SCXK(湘)2015-0001][SYXK(湘)2015-0001]。通過口服管飼法每天處理小鼠，并單獨飼養在25℃和55%(相對濕度)的籠中。

1.2 主要試劑

T試劑盒、Trizol、PCR試劑盒購自Promega公司；Taq聚合酶、RNase inhibitor購自TaKaRa公司；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、ELISA試劑盒購自美國Pierce公司；兔抗鼠Bcl-2、Bax、caspase-3、FAS、FASL、p65、β-actin和TPB抗體購自Santa Cruz。

1.3 實驗方法

1.3.1 燕麥β-葡聚糖的提取

山西產燕麥品種：晉燕8號，山西省農科院高寒作物研究所提供。燕麥原料經布勒磨粉機分離燕麥麩皮和燕麥粉。收集麩皮并粉碎過篩后冷藏備用。根據Bhatty[5]和Ahmad[6]所述的方法，從燕麥麩中提取高分子量β-葡聚糖,不同之處在于固體：液體比例為1∶8，pH 7.0。通過控制酸水解時間(HCl，pH 1.0，80℃)，從初始分離物獲得中等分子量的β-葡聚糖和低分子量β-葡聚糖的樣品。然后將分離物進行徹底透析3 d，并通過冷凍干燥濃縮。通過AOAC官方方法995.16，使用測定試劑盒(Megazyme International，Bray，Ireland)測定每種樣品的總β-葡聚糖含量。通過具有多角度激光散射(SEC-LLS)的尺寸排阻色譜法測定β-葡聚糖樣品的分子量的值。使用凱氏定氮法測定蛋白質的量。通過在121℃的真空烘箱中將稱重的樣品干燥5 h并測量重量損失來分析水分。使用Ubbelohde毛細管粘度計，在37℃下測定各β-葡聚糖溶液的特性粘度[η]，并根據Huggins方程進行計算。3%(w/v)燕麥β-葡聚糖溶液進行流變學測量。通過配有錐板幾何形狀(4,20 mm)的受控應變流變儀(TA Instrument，USA)測量粘度，并且在37℃從0.1/s～100/s的剪切速率下進行穩定剪切速率掃描。

1.3.2 實驗分組與處理

60只大鼠隨機分為正常對照組(NC組，n=20),實驗對照組(TC組，n=20)，燕麥β-葡聚糖組(Oglu組，n=20)。實驗前均適應性喂養3 d。TC組和Oglu組以CLP法[7,8]建立膿毒癥模型。建模方法：實驗大鼠用氯胺酮(60 mg/kg，肌注)麻醉，仰面固定四肢在操作臺上，隨后在腹部中線行一個2 cm切口，暴露盲腸，找到回盲瓣的遠端，用18號針頭穿刺兩次，并擠出少許糞便，將腸管返回腹腔。逐層縫合腹部傷口，術后用立即30 mL / kg生理鹽水復蘇，然后將動物放回籠內。Oglu組經口灌胃給予3%的Oglu溶液，依據文獻給予不同劑量[9]：500 mg/(kg·d)；1000 mg/(kg·d)；2000 mg/(kg·d)。TC組予以糖鹽水喂養，實驗12 h后三組分別處死10只大鼠[8]，取各組大鼠全部小腸組織，分為3部分：一部分用蒸餾水漂洗，浸泡于多聚甲醛中，進行病理切片觀察[10]；一部分用0.9%生理鹽水按10%濃度制成勻漿，3000 r/min離心10 min，取上清液，冷凍于液氮中，用ELISA試劑盒檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β及IL-6，依據文獻，以小腸粘膜病理損傷及炎癥因子確認膿毒癥模型[11]。

1.3.3 RNA提取與實時定量PCR

采用實時定量PCR法檢測腸道組織細胞膜外Toll樣受體(Toll-like receptors, TLR2、TLR4、TLR5、TLR6)基因表達。即將腸組織制成勻漿后，采用TRIzol試劑提取細胞總RNA，并將其逆轉錄為cDNA。加入10 mmol/L 正向和反向引物以及SYBR后(Invitrogen, Carlsbad, CA)，實時定量PCR于ABI 7500上進行擴增。擴增條件：94℃預變性10 min，隨后進入以下35個循環：94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 3 min。本研究所用的引物如下：TLR2：forward 5′- GCTCCTGTGACTTCCTGTCC-3′, reverse 5′- CCG AAAGCACAAAGATGGTT-3′; TLR4： forward 5′- AG GCAGCCATAACTTCTCCA-3′, reverse 5′- GGTTGAG TAGGGGCATTTGA-3′；TLR5：forward 5′- AACGCTTT GCTCAAACACCT-3′, reverse 5′- ACCCTCTGATGGA CTGATGC-3′；TLR6：forward 5′- ACTGACCTTCCTGG ATGTGG-3′, reverse 5′- GCACCACTCACTCTGGACA A-3′；β-actin, forward 5′-ACC CAC ACT GTG CCC ATC TA-3′, reverse 5′-CGG AAC CGCTCA TTG CC-3′。結果以2-ΔΔCt表示。

1.3.4 蛋白提取與Western blot分析

采用Western blot檢測小腸組織Bcl-2、Bax、caspase-3、FAS和FASL基因的表達以及NF-κB的核轉位。即采用Pierce提供的試劑盒提取細胞總蛋白和核蛋白。測定其濃度后，將加入等體積的2×SDS上樣緩沖液煮沸5 min，取20 μL蛋白用于SDS-PAGE。電泳結束后，將其電轉印到硝酸纖維素膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，后，加入兔抗鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3、FAS、FASL以及p65或β-actin或TPB一抗(Santa Cruz)4℃孵育過夜，并采用ECL發光(Millipore,Billerica,MA)、顯影(VL Chemi-Smart 3000,Viogene Biotek, CA)。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 病理組織學

病理學分析顯示正常組腸粘膜完整(圖1 A)。 膿毒癥組中，上皮細胞間隙增大，絨毛上皮細胞和隱窩細胞數量減少，絨毛上皮排列紊亂，大量炎性細胞浸潤(圖1B)。相比之下，在燕麥β-葡聚糖組中，上皮細胞間隙僅在少數區域擴大，隱窩上皮細胞豐富，炎性細胞減少(圖1C)。

2.2 各組小腸組織中炎性因子水平比較

膿毒癥組小腸組織中TNF-α、IL-1β及IL-6水平顯著高于正常對照組及燕麥β-葡聚糖組(P< 0.05)；燕麥β-葡聚糖組仍高于正常對照組(P< 0.05)。(表1)

2.3 各組小腸損傷相關基因表達

2.3.1 燕麥β-葡聚糖對膿毒癥大鼠小腸組織Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

與正常對照組相比，膿毒癥組(TC組)Bcl-2 蛋白表達下調，Bax表達明顯增加，燕麥β-葡聚糖處理后Bcl-2蛋白表達上調，而Bax蛋白表達下降，并且隨燕麥β-葡聚的劑量增加而下降明顯。見圖2。

2.3.2 燕麥β-葡聚糖對膿毒癥大鼠小腸組織Caspase-3活化表達的影響

注：A：對照組；B：膿毒癥組；C：Oglu組。圖1 各組空腸組織病理學檢查(Bar=100 μm)Note.A：Control group；B：Sepsis group；C：Oglu group.Fig.1 Histopathological examination of jejunum in each group.HE staining表1 各組小腸組織中TNF-α、IL-1β及IL-6水平(pg/mg)Tab.1 TNF-α, IL-1β and IL-6 levels in the small intestine

炎癥因子Inflammatoryfactor正常對照組Controlgroup 膿毒癥組Sepsisgroup燕麥β?葡聚糖組OglugroupTNF?α102±010472±044?280±031?#IL?1β019±001626±071?379±023?#IL?6 052±001589±078?392±027?#

注：與正常對照組比較，*P< 0.05；與膿毒癥組比較，#P< 0.05。

Note.Compared with the normal control group,*P< 0.05; compared with the sepsis group,#P< 0.05.

注：1：NC組；2：TC組；3∶500 mg/kg·d Oglu組；4∶1000 mg/kg·d Oglu組；5∶2000 mg/kg·d Oglu組。圖2 各組大鼠小腸組織Bcl-2和Bax蛋白表達Note.1：NC group; 2：TC group; 3∶500 mg/kg·d Oglu group; 4∶1000 mg/kg·d Oglu group; 5∶2000 mg/kg·d Oglu group.Fig.2 Expression of Bcl-2 and Bax proteins in the small intestine of rats

注：A：各組大鼠小腸組織細胞膜外Toll樣受體表達；B：實時定量PCR擴增曲線；1：正常對照組；2：膿毒癥組；3∶500 mg/kg·d Oglu組；4∶1000 mg/kg·d Oglu組；5∶2000 mg/kg·d Oglu組。；與正常對照組相比，* P< 0.05;與膿毒癥組相比，#P< 0.05。圖4 各組大鼠小腸組織細胞膜外Toll樣受體表達及PCR擴增Note.A：Expression of Toll-like receptor in the small intestine tissue of rats in each group；B：Real-time quantitative PCR amplification curve；1：Normal control group; 2：TC group; 3∶500 mg/kg·d Oglu group; 4∶1000 mg/kg·d Oglu grop; 5∶2000 mg/kg·d Oglu grop；Compared with the normal control group, *P < 0.05; compared with the TC group,#P < 0.05.Fig.4 Expression and proliferation of Toll-like receptors and PCR amplification in the small intestine of rats in each group

與正常對照組相比，膿毒癥組(TC組)Caspase-3蛋白表達明顯增加，燕麥β-葡聚糖處理后Caspase-3蛋白表達下降，并且隨燕麥β-葡聚有劑量增加而下降明顯。見圖3。

注：1：NC組；2：TC組；3∶500 mg/kg·d Oglu組；4∶1000 mg/kg·d Oglu組；5∶2000 mg/kg·d Oglu組。圖3 各組大鼠小腸組織Caspase-3活化表達Note.1：NC group; 2：TC group; 3∶500 mg/kg·d Oglu group; 4∶1000 mg/kg·d Oglu group; 5∶2000 mg/kg·d Oglu group.Fig.3 Expression of caspase-3 in the small intestine of rats in each group

2.3.3 燕麥β-葡聚糖對膿毒癥大鼠腸道組織細胞膜外Toll樣受體(TLR2、TLR4、TLR5、TLR6)基因表達的影響

與正常對照組相比，膿毒癥組(TC組)Toll樣受體2,4,5表達明顯增加，燕麥β-葡聚糖處理后各Toll樣受體表達下降，并且隨燕麥β-葡聚有劑量增加而下降明顯。見圖4。

2.3.4 燕麥β-葡聚糖對膿毒癥大鼠小腸細胞凋亡時FAS和FASL基因表達的影響

膿毒癥大鼠小腸細胞凋亡基因FAS和FASL表達明顯增加，而燕麥β-葡聚糖下調FAS和FASL凋亡基因的表達，隨麥β-葡聚糖劑量增加，兩者表達明顯減少。見圖5。

2.3.5 燕麥β-葡聚糖對膿毒癥大鼠小腸組織NF-κB p65亞基核轉位的影響

膿毒癥模型組中細胞核內NF-κB亞基p65含量明顯增高，而用不同濃度Oglu處理后，細胞核內p65水平逐漸降低，表明NF-κB活性受到抑制。而細胞核內參TBP(TATA盒結合蛋白)水平無明顯變化。見圖5。

注：1：NC組；2：TC組；3∶500 mg/kg·d Oglu組；4∶1000 mg/kg·d Oglu組；5∶2000 mg/kg·d Oglu組。圖5 各組大鼠小腸組織FAS和FASL表達Note.1：NC group; 2：TC group; 3∶500 mg/kg·d Oglu group; 4∶1000 mg/kg·d Oglu group; 5∶2000 mg/kg·d Oglu group.Fig.5 Expression of FAS and FASL in the small intestine of rats in each group

注：1：NC組；2：TC組；3∶500 mg/kg·d Oglu組；4∶1000 mg/kg·d Oglu組；5∶2000 mg/kg·d Oglu組。圖6 各組大鼠小腸組織NF-κB表達Note.1：NC group; 2：TC group; 3∶500 mg/kg·d Oglu group; 4∶1000 mg/kg·d Oglu group; 5∶2000 mg/kg·d Oglu group.Fig.6 Expression of NF-κB in the small intestine of rats in each group

3 討論

大量的基礎及臨床研究均已表明燕麥β-葡聚糖對腸道有很好的保健作用[12,13]，燕麥β-葡聚糖纖維在減少心血管疾病風險和控制血糖方面的作用已得到廣泛的確認，但其他潛在的益處，包括調節腸道微生物群和炎癥，仍在被探索[14]。膳食β-葡聚糖可能會改變幼豬腸組織反應，在斷奶后期特異性調控了腸段基因的選擇和形態的表達[15]。在給予回腸造口術患者富含燕麥β-葡聚糖飲食后發現，其小腸和結腸細胞系免疫功能是增強的，這些對腸細胞的免疫刺激作用有可能有助于增強宿主對侵襲性病原體的抵抗能力[16]。

本研究建立膿毒癥模型，發現其膿毒癥能明顯誘導大鼠小腸損傷，而燕麥β葡聚糖能減輕膿毒癥誘導的小腸病理改變，能抑制炎癥反應，如膿毒癥模型大鼠中小腸組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平的降低所示。進一步探索燕麥β葡聚糖保護小腸的分子機制，動物實驗發現燕麥β-葡聚糖對腸道功能的調節影響到基因層次，其抑制長鏈脂肪酸和膽固醇的體外腸吸收，是由于β-葡聚糖下調參與脂肪酸合成和膽固醇代謝的基因的表達，減少腸道脂肪酸結合蛋白和脂肪酸轉運蛋白4 mRNA[17]。同樣我們知道膿毒癥模型中存在大鼠小腸上皮細胞凋亡，Bcl-2家族基因Bcl-2表達下調，而Bax表達升高[18,19]。Bcl-2蛋白是bcl-2原癌基因的編碼產物，是細胞存活促進因子，Bcl-2蛋白家族是一個特別的家族，目前已發現25種Bcl-2家族同源蛋白，其成員中有些促進凋亡，如Bad、Bid、Bax，有些成員阻止細胞凋亡,如Bcl-2、Bcl-x、Bcl-w、Bcl-2能夠阻止細胞色素C從線粒體釋放到細胞質，從而抑制了細胞凋亡。本研究使用燕麥β-葡聚糖干預后，RT-PCR顯示Bcl-2表達上調，Bax表達下調，Bax / Bcl-2比例有所改善，提示燕麥β-葡聚糖能明顯防止膿毒癥誘導的小腸上皮細胞凋亡，且增加燕麥β-葡聚糖劑量，能提升這種保護效應。Caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，也是細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)殺傷機制的重要組成部分，細胞凋亡受到嚴格調控,在正常細胞caspase處于非活化的酶原狀態，凋亡程序一旦開始，caspase被活經隨后發生凋亡蛋白酶的層疊級聯反應，發生不可逆的凋亡，在腸上皮細胞凋亡中發揮重要作用[20]。我們的研究中發現，膿毒癥模型小腸組織caspase-3表達增加，喂食燕麥β-葡聚糖后能明顯抑制caspase-3的表達，從而減少了小腸上皮細胞的凋亡，且在實驗使用的劑量范圍內有一定的劑量依賴性。

Toll樣受體是參與非特異性免疫(天然免疫)的一類重要蛋白質分子，當微生物突破機體的物理屏障，如皮膚、粘膜等時，TLR可以識別它們并激活機體產生免疫細胞應答[21]。腸上皮細胞表達Toll樣受體，其在保守的微生物因子如脂多糖(LPS)上誘導上皮反應，包括上皮細胞增殖，分泌型IgA分泌到內腔中并產生粘蛋白和抗微生物肽，從而促進腸屏障功能[22]。在腸上皮細胞和對照魚的固有層細胞中，TLR2以低水平表達。腸上皮通過其促炎基因的表達，炎性細胞因子的釋放和炎性細胞的募集直接參與粘膜免疫反應。如在炎癥性腸病腸易激綜合征患者小腸粘膜中Toll樣受體2,4,5和9的表達明顯增加[23,24]。膿毒癥小腸粘膜存在炎癥反應，在本研究中，膿毒癥大鼠空腸組織中Toll樣受體2,4,5表達較正常對照組明顯增加，而在燕麥β-葡聚糖組表達下降，提示了燕麥β-葡聚糖可能導致腸黏膜TLRs的表達下降及其信號轉導通路活化減弱，從而減輕腸粘膜炎癥。

Fas/FasL作為可直接啟動細胞凋亡的信號途徑，也是是負向調節介導腸上皮細胞細胞凋亡最為重要的膜蛋白分子[25]。在本研究中，膿毒癥組小腸組織Fas/FasL基因表達明顯增加，而燕麥β-葡聚糖組Fas和Fasl凋亡基因的表達明顯下調,隨燕麥β-葡聚糖劑量增加，這種效應更加明顯。前面的研究均提示燕麥β-葡聚糖可以調節腸道免疫反應，富含燕麥β-葡聚糖的糞便水刺激細胞因子誘導的腸細胞免疫反應[16]。使用燕麥β-葡聚糖的小鼠在腸細胞中表現出增加的腸NF-κB反式激活，特別是在小腸近端(回腸)，但是在結腸中未被激活[26]。本研究膿毒癥模型組中細胞核內NF-κB亞基p65含量明顯增高，而用不同濃度燕麥β-葡聚糖處理后，p65水平逐漸降低，表明NF-κB活性受到抑制。

綜上所述，燕麥β-葡聚糖能通過不同途徑抑制膿毒癥大鼠的小腸細胞凋亡，從而實現其膿毒癥腸道保護作用，但是如在動物和人體中觀察到的，燕麥β-葡聚糖對腸道免疫的影響研究還處在初期，從宏觀到微觀的潛在機制，都需要進一步評估。

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Effectsofoatβ-glucanontheexpressionofsmallintestineinjury-relatedgenesinsepticrats

WU Kun-peng1， CHEN Ying2， HUANG Zhi-jia1*， YAN Cai-hong1

(1.Department of Intensive Care Medicine,The Second Hospital Affiliated to South China University,Hengyang 421001，China； 2.Department of Anesthesia，The Second Hospital Affiliated to South China University,Hengyang 421001)

ObjectiveTo explore the effect of oat β-glucan on gene expression in small intestine injury in sepsis.MethodsSD rats were randomly divided into normal control group (NC group), experimental control group (TC group) and oat β-glucan group (Oglu group).TC group and Oglu group were used to establish sepsis model with CLP method ,and oglu group with different doses of oat β-glucan. After 12 h the small intestine tissue were collected. Western blot was used to detect gene expression in the small intestine tissue injury.Results1)Oat β-glucan reduced sepsis-induced small intestine injury,and reduced the TNF-α, IL-1β and IL-6 levels in small intestine of septic rats.(2) The expression of small intestinal injury-related proteins such as Bax, caspase-3, Toll-like, apoptotic genes FAS and FASL and NF-κB were significantly increased,and Bcl-2 expression was down-regulated in the TC group.(3)The expressions of Bax, caspase-3, Toll-like, apoptotic genes FAS and FASL and NF-κB in oat β-glucan-treated rats were lower than that in the septic rats, while Bcl-2 expression was higher than the TC group.ConclusionsOat β-glucan regulates the expression of small intestinal injury genes in septic rats and protects the small intestinal epithelium against sepsis-induced injury.

Oat β-glucan; Sepsis; Intestinal mucosa

2017-05-22

湖南省教育廳基金(15C1212)。

吳昆鵬(1980-)，男，主治醫師，研究方向：膿毒癥。E-mail: iron_head@yeah.net

黃治家(1983-)，男，主治醫師，研究方向：膿毒癥。E-mail: 35675205@qq.com

R-33

A

1671-7856(2017) 12-0039-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.12.007

〔收稿日期〕2017-05-30