二甲雙胍對小鼠衰老過程中學習記憶能力的影響

張麗君，張麗霞，王郝瑩，張 瓊，李莉紅，軒瑞晶，王昭君，郭建紅*

(1.山西醫科大學病理生理學教研室，太原 030001； 2.山西醫科大學實驗動物中心，實驗動物與人類疾病動物模型 山西省重點實驗室，太原 030001； 3.山西醫科大學生理學系, 細胞生理學省部共建教育部重點實驗室，太原 030001)

二甲雙胍對小鼠衰老過程中學習記憶能力的影響

張麗君1，張麗霞1，王郝瑩1，張 瓊1，李莉紅2，軒瑞晶2，王昭君3，郭建紅1*

(1.山西醫科大學病理生理學教研室，太原 030001； 2.山西醫科大學實驗動物中心，實驗動物與人類疾病動物模型 山西省重點實驗室，太原 030001； 3.山西醫科大學生理學系, 細胞生理學省部共建教育部重點實驗室，太原 030001)

研究報告

目的探究D-半乳糖誘導小鼠衰老過程中補充二甲雙胍對小鼠學習記憶能力的影響及可能機制。方法將24只雌性ICR小鼠隨機分為3組:對照組、衰老組、衰老+二甲雙胍組，每組8只，連續給藥16周。監測各組小鼠體重及食物攝取量；行為學檢測小鼠學習記憶能力；HE染色觀察小鼠海馬組織結構；比色法檢測各組小鼠海馬組織中谷胱甘肽(glutathione, GSH)水平。結果與衰老組相比，衰老+二甲雙胍組小鼠體重降低(P< 0.05)；Morris水迷宮逃避潛伏期、游泳路程明顯減少(P< 0.01或P< 0.05)，目標象限內游泳時間延長(P< 0.05)，游泳速度加快(P< 0.05)；穿梭實驗中主動回避次數升高(P< 0.05)；HE染色顯示海馬齒狀回中核皺縮、深染的海馬神經元明顯減少；海馬組織GSH水平顯著升高(P< 0.05)。結論補充二甲雙胍可以明顯延緩小鼠衰老過程中學習記憶能力的下降，維持海馬神經元正常結構，其機制可能與降低小鼠體重及增強海馬組織抗氧化水平有關。

二甲雙胍；衰老；氧化應激；海馬神經元

二甲雙胍是目前廣泛用于治療二型糖尿病(type 2 diabetes，T2DM)的一線藥物[1]。隨著現代醫學科研水平的不斷進步，二甲雙胍的治療潛力已經遠遠超出其常規的作為治療糖尿病的用途。越來越多的文獻報道，補充二甲雙胍可以降低多種疾病(包括癌癥[2]和心血管疾病[3])的發病率；減輕肝臟脂肪變性[4]；調節腸道微生物群促進健康[5]；甚至延緩衰老進程[6]。然而，二甲雙胍對于小鼠衰老過程中中樞神經系統的作用尚未完全闡明[7]。本實驗通過使用D-半乳糖誘導小鼠衰老同時補充二甲雙胍，運用行為學及組織學等方法檢測小鼠學習記憶、運動功能、海馬組織結構以及氧化應激穩態的變化，用以評估二甲雙胍在腦組織衰老過程的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級7月齡雌性ICR小鼠24只，體重(50.67±1.66)g，由長沙市天勤生物技術有限公司提供[SCXK(湘)2014-0011]。所有動物在本實驗室獨立動物房飼養[SYXK(晉)2015-0001]，室溫(22±2)℃，12 h光照/12 h黑暗循環，提供充足食物及飲水。按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2 主要試劑及儀器

D-半乳糖(G5388-100G Sigma，美國)；鹽酸二甲雙胍(D9351索萊寶，北京)；生理鹽水(石家莊四藥有限責任公司)；GSH檢測試劑盒(A006-1，南京建成生物工程研究所)；BCA蛋白定量試劑盒(KGP920，凱基生物)； Morris水迷宮視頻跟蹤系統(Ethovision 3.0，Noldus Information Technology，荷蘭)；小鼠穿梭箱(上海欣軟信息科技有限公司，中國)；高速離心機(GL-20C，美國)；分光光度計(上海第三分析儀器廠，中國)；酶標儀(SpectraMAX 190，USA)等。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組及處理

24只雌性ICR小鼠適應性飼養2周后，按數字隨機表法分為正常對照(control，Ctr.)組，D-半乳糖誘導衰老模型(D-gala)組，誘導衰老同時補充二甲雙胍(D+Met)組，每組8只。D+Met組和D-gal組每日頸背部皮下注射D-半乳糖(D-galactose 125 mg/kg·d)誘導衰老，同時給予二甲雙胍(metformin 300 mg/kg·d)或同等劑量0.9%生理鹽水灌胃；Ctr.組給予注射、灌胃等劑量生理鹽水。連續給藥16周，每天監測小鼠食物攝取量，每周稱取小鼠體重。

1.3.2 Morris水迷宮

經典Morris水迷宮實驗主要監測小鼠長期空間學習記憶能力。實驗共分三個階段，第一階段為定位航行階段，為期5 d，從4個不同象限將小鼠面朝水池內壁依次放入水池中，記錄其1 min內找到水下平臺所用的時間，為逃避潛伏期(escape latency，EL)，同時記錄小鼠游泳路程；第二階段為空間探索，即第6天撤走平臺，隨機選出2個象限，將小鼠面朝水池內壁依次從該象限放入水中，讓其自由探索1 min，記錄小鼠游泳軌跡并計算小鼠在目標象限內游泳時間占總時間的百分比(time in target quadrant)；第三階段為可視平臺實驗，將平臺抬高至水面1 cm，隨機選取2個象限，將小鼠依次放入水池中，記錄小鼠找到平臺所用時間及速度。

1.3.3 穿梭箱實驗

水迷宮實驗結束后對小鼠進行為期7 d的穿梭箱實驗，每天1次。具體做法如下：將小鼠放入穿梭箱中，適應30 s后給予燈光(光照強度為90級)和蜂鳴音刺激(聲音強度為80級，頻率為500 Hz)，刺激持續10 s，若此時動物從隔板的圓孔中到達對側暗箱則為主動回避反應(active avoidance response，AAR)；若未到達對側暗箱，繼續給予0.4 mA電刺激，持續時間為5 s，若此時動物穿梭至對側則為被動回避反射(passive avoidance response，PAR)；若給予電刺激后動物仍停留在同側暗箱中，則為逃避失敗(escape failure，EF)。統計AAR次數作為其學習記憶成績的評價指標[8]。

1.3.4 HE染色觀察海馬形態結構

行為學實驗結束后，1%戊巴比妥麻醉小鼠，迅速斷頭取腦，分離右側海馬組織置于-80℃冰箱中備用，將左側腦組織置于4%多聚甲醛進行固定。固定24 h后，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，經冠狀面切片(切片厚度為5 μm)，行蘇木素-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察各組海馬組織結構變化。

1.3.5 抗氧化水平檢測

準確稱取新鮮海馬組織，按試劑盒說明書制備勻漿，檢測蛋白濃度，采用二硫代二硝基苯甲酸與巰基化合物反應時產生一種黃色化合物，經分光光度計比色測定，計算各樣品GSH實際濃度(mg/gprot)。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 各組小鼠體重及食物攝入量情況

表1為各組小鼠每四周體重變化情況：隨著年齡的增加，各組小鼠體重均出現明顯升高。自第8周至實驗結束，D+Met組小鼠的體重低于Ctr.組(P< 0.05)，實驗結束時該組小鼠體重低于D-gala組(P< 0.05)。表2為各組小鼠食物攝取量：D+Met小鼠的食物攝取量自第8周起低于正常對照組(P< 0.05)，雖然該組小鼠的食物攝取量低于衰老模型組，但差異無顯著性(P> 0.05)。

2.2 各組小鼠Morris水迷宮測試結果

圖1 A為各組小鼠定位巡航實驗。隨著訓練次數的增加，各組小鼠逃避潛伏期的時間均出現不同程度減少，第3～5天，D-gala小鼠逃避潛伏期較Ctr.小鼠明顯增加(P< 0.001)，而D+Met小鼠顯著低于D-gala小鼠(P< 0.01或P< 0.001)。圖1B為各組小鼠游泳路程。如圖所示，Ctr.小鼠及D+Met小鼠的游泳路程逐漸減少，而D-gala小鼠游泳路程幾乎沒有變化(P< 0.05)。說明D-gala小鼠出現明顯的空間學習障礙，而補充二甲雙胍可改善這種學習能力。

圖1C為第6天各組小鼠空間探索實驗中代表性游泳軌跡圖。經統計分析得到圖1D：D-gala小鼠在目標象限內游泳時間占總時間的百分比顯著低于Ctr.及D+Met小鼠(P< 0.01或P﹤0.05)。圖1E為小鼠游泳熱力圖，Ctr.及D+Met小鼠目標象限內停留時間均高于D-gala小鼠。這些數據表明，D-gala小鼠空間記憶能力明顯受損，補充二甲雙胍可明顯改善空間記憶能力。

圖2F及2G分別為可視平臺實驗中各組小鼠找到平臺所用時間及游泳速度。如圖所示，各組小鼠找到平臺所用的時間差異無顯著性(P> 0.05)，而D+Met小鼠游泳速度明顯加快(P< 0.05)。說明D-gala小鼠逃避潛伏期的延長、游泳路程的增加及在目標象限內游泳時間的減少不是由于視力問題，而是出現明顯的學習、記憶能力受損。

2.3 各組小鼠穿梭實驗中的主動回避次數

穿梭實驗結果如圖2所示。隨著訓練次數的增加，各組小鼠主動回避次數明顯增多，第4～7天，與Ctr.組相比，D-gala小鼠主動回避次數顯著降低(P< 0.05或P<0.01)，第6～7天D+Met小鼠主動回避次數高于D-gala小鼠(P< 0.05)。這一結果表明，D-gala小鼠學習記憶能力下降，而補充二甲雙胍可明顯改善衰老小鼠的學習記憶能力。

表1 各組小鼠體重變化Tab.1 Changes of body weight in the mice

注：與對照組相比較,*P< 0.05；與D-gala組相比較,#P< 0.05。

Note.Compared with the control group,*P< 0.05. Compared with the D-gala group,#P< 0.05.

表2 各組小鼠食物攝入量變化Tab.2 Changes of food intake of the mice in each group

注：與對照組相比較,*P< 0.05；與D-gala組相比較,#P< 0.05。

Note.Compared with the control group,*P< 0.05. Compared with the D-gala group,#P< 0.05.

注：C：空間探索實驗中小鼠游泳軌跡；E：各組小鼠空間探索游泳熱力圖。與對照組相比較，* P< 0.05，** P< 0.01，***P< 0.001；與D-gala組相比較，#P< 0.05，##P< 0.01，###P< 0.001。圖1 Morris水迷宮測試各組小鼠長時程空間學習記憶能力變化Note.C: Sample swimming traces of mice in different groups tested by hidden platform test. E:Swimming thermographic diagram of probe test of the mice in different groups. Compared with the control group,* P< 0.05,** P< 0.01,***P< 0.001. Compared with the D-gala group,#P< 0.05,##P< 0.01,###P< 0.001.Fig.1 Results of Morris water maze test of the spatial learning and memory ability of mice

2.4 海馬組織HE染色

圖3 A-C分別為各組小鼠海馬齒狀回區域HE染色圖，Ctr.小鼠(圖A)，海馬神經元排列緊密，細胞形態結構正常；與D-gala組相比，D+Met小鼠(圖C)，呈三角形或不規則型皺縮、深染的海馬神經元明顯減少。

2.5 各組小鼠海馬組織GSH含量

如圖4所示，與Ctr.相比，D-gala小鼠海馬中GSH含量明顯下降(P< 0.05)，而補充二甲雙胍可恢復衰老小鼠海馬組織中GSH水平(P< 0.05)。

3 討論

人口老齡化是21世紀全球都將面臨的重大問題。減緩衰老進程，改善老年人健康已成為各國科學領域研究重點。當前，國際上正在開展替代藥物發展戰略，即利用現有藥物治療其他疾病。這樣既可以節省相當多的時間和金錢，同時由于這些藥物的藥代動力學、藥效學和安全性已經建立，繞開了臨床前研究這一繁瑣環節而被許多國家提倡。二甲雙胍正是目前研究的新型藥物之一[9]。

注：與對照組相比較，* P< 0.05，** P< 0.01；與D-gala組相比較，#P< 0.05。圖2 穿梭箱實驗檢測各組小鼠學習記憶能力變化Note.Compared with the control group,* P< 0.05,** P< 0.01. Compared with the D-gala group,#P< 0.05.Fig.2 Changes of learning and memory ability of the mice in each group assessed by shuttle-box test

注：A,a：對照組；B,b：D-gala組；C,c：D+Met組。圖3 各組小鼠海馬齒狀回區域HE染色圖Note.A,a: control group. B,b: D-gala group. C,c: D+Met group. Fig.3 Comparison of the histology of hippocampal dentate gyrus in the mice.HE staining

于其治療效果好、副作用小、價格便宜等優勢，目前世界上約有1.5億2型糖尿病人服用二甲雙胍[10]。雖然二甲雙胍在體內的代謝過程已經闡明[11]，并且證實其的確可以通過血腦屏障[12]，但是，近年來，研究者們發現二甲雙胍對大腦中樞神經系統的作用出現了自相矛盾的結論。一些研究顯示二甲雙胍可以促進腦神經再生[13]、改善學習記憶能力[14]，降低認知衰退的風險[15]；而另一些研究則出現相反的結果，如二甲雙胍加重阿爾茨海默病(Alzheimer’ s disease，AD)發生的風險[16]，促進受損神經元的存活[17]以及導致AD模型大鼠的認知功能障礙的惡化[18]。由于二甲雙胍對中樞神經系統存在不確定的作用，本文旨在應用不同方法檢測二甲雙胍對衰老小鼠學習記憶、運動功能的作用，從而為二甲雙胍是否可以作為一種抗中樞神經系統衰老藥物被用于臨床研究作出一定貢獻。

由慢性施用D-半乳糖誘導神經毒性作用是目前廣泛用于研究衰老和記憶障礙的常見模型[19]。查詢美國國家醫學圖書館PubMed數據庫，截止2017年5月，發表D-半乳糖誘導小鼠衰老模型相關文獻已達800多篇，但二甲雙胍對D-半乳糖誘導衰老模型的相關作用尚未見報道。本文旨在觀察二甲雙胍對D-半乳糖誘導的衰老小鼠學習記憶能力的影響及有關機制研究。首先，我們對D-半乳糖誘導的衰老小鼠進行Morris水迷宮及穿梭實驗測試，結果顯示衰老小鼠逃避潛伏期、游泳路程顯著增加、在目標象限內游泳時間以及主動穿梭次數明顯下降，提示衰老小鼠學習記憶能力明顯衰退，與曹雪姣等[20]的實驗結論相一致。其次，DiTacchio等[21]發現補充二甲雙胍對雌性小鼠的學習記憶能力發揮保護作用，本實驗中二甲雙胍的補充同樣改善衰老小鼠空間和非空間(水迷宮和穿梭實驗)學習記憶能力，這與上述研究結果一致。實驗中，我們還發現，補充二甲雙胍可降低小鼠食物攝取量并減輕小鼠體重，與先前報道的給中年小鼠補充二甲雙胍，其體重明顯小于年齡匹配的對照組[22]的結果相同。此外，另有文獻報道[23]D-半乳糖可誘導嚙齒類動物大腦氧化失衡，導致腦組織神經變性、記憶缺陷等腦衰老表現，這與我們觀察到施用D-半乳糖降低小鼠體內GSH含量相一致。而補充二甲雙胍可明顯恢復體內GSH水平，提高海馬組織抗氧化能力，從而發揮對海馬組織的保護作用。但二甲雙胍作為抗氧化調節劑如何調節氧化應激、降低小鼠體重，改善其學習記憶能力，相關實驗正在進行中。

注：與對照組相比，* P< 0.05；與D-gala組相比，#P< 0.05。圖4 各組小鼠海馬組織中GSH變化情況Note.Compared with the control group,* P< 0.05. Compared with the D-gala group,#P< 0.05.Fig.4 Changes of glutathione (GSH) contents in hippocampal tissues of the mice

總之，本實驗運用行為學及組織學方法研究D-半乳糖誘導小鼠衰老過程中補充二甲雙胍對小鼠學習記憶、運動功能及海馬神經元的影響，結果表明二甲雙胍可以延緩腦衰老過程中學習記憶能力的下降，維持海馬神經元正常結構，這一保護作用可能與降低小鼠體重以及維持海馬組織中抗氧化水平有關。

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Effectofmetforminonlearningandmemoryabilityinmiceduringagingandthepossibleunderlyingmechanisms

ZHANG Li-jun1， ZHANG Li-xia1， WANG Hao-ying1， ZHANG Qiong1， LI Li-hong2， XUAN Rui-jing2， WANG Zhao-jun3， GUO Jian-hong1*

(1.Department of Pathophysiology,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001, China; 2.Laboratory Animal Center, Shanxi Key Laboratory of Experimental Animal Science and Hunman Disease Animal Model, Taiyuan 030001； 3.Department of Physiology, Key Laboratory for Cellular Physiology of Ministry of Education, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001)

ObjectiveTo explore the effect of metformin on learning and memory ability and hippocampal tissue structure in mice during aging induced by D-galactose, and the possible underling mechanisms.MethodsTwenty-four SPF 7-month-old female ICR mice were randomly divided into three groups. Mice of the aging group and aging+metformin group were given subcutaneous injection with D-galactose on the back to induce senescence, and given intragastric gavage with 0.9% saline or metformin. Mice of the control group were treated with 0.9% saline. All treatments lasted for 16 weeks. The body weight and food intake were monitored, learning and memory ability and motor function were tested by Mirros water maze and shuttle box tests, HE staining was used to observe the pathology of hippocampus in the mice, and the levels of glutathione (glutathione, GSH) in hippocampus of mice were detected by colorimetry.ResultsCompared with the aging group, the aging+meformin group showed diverse differences: the body weight was decreased (P< 0.05), the escape latency and swimming distance were decreased (P< 0.01 orP< 0.05), the swimming time in the target quadrant was prolonged (P< 0.05) and swimming speed was accelerated (P< 0.05) in the Morris water maze test. The numbers of active avoidance response were markedly increased in shuttle box test (P< 0.05). The neurons with nuclear condensation and deep staining were obviously decreased in the dentate gyrus of hippocampus, however the GSH level was significantly increased (P< 0.05).ConclusionsMetformin can delay the decline of learning and memory ability, maintain the normal structure of hippocampus during the aging process in mice, which may be related to the reduction of body weight and enhancement of antioxidant levels in the hippocampus.

Metformin; Aging; Oxidative stress; Hippocampal neurons

2017-04-25

山西省自然科學基金資助(201311054-2)。

張麗君(1987-)，女，研究生，研究方向：衰老及相關疾病。E-mail: zlj202020@163.com

郭建紅(1968-)，女，副教授，博士，研究方向：衰老及相關疾病。E-mail: sgs7551@126.com

R-33

A

1671-7856(2017) 12-0033-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.12.006