不同促滲劑對蒿甲醚軟膏體外透皮吸收的影響

王 敏 董雪榮 李 靜 阮佳琦 高琳惠 屠李嬋 于小紅

(首都醫科大學中醫藥學院,北京,100069)

不同促滲劑對蒿甲醚軟膏體外透皮吸收的影響

王 敏 董雪榮 李 靜 阮佳琦 高琳惠 屠李嬋 于小紅

(首都醫科大學中醫藥學院,北京,100069)

目的:考察促滲劑氮酮、冰片、薄荷油對蒿甲醚軟膏體外透皮吸收的影響。方法:使用智能透皮試驗儀,選擇小鼠腹皮為滲透屏障,對含3種促滲劑及其復配體系的軟膏進行體外經皮擴散實驗,HPLC測定蒿甲醚的累積透過量和經皮擴散速率。結果:2%氮酮、2%冰片、2%薄荷油,2%氮酮+2%冰片、2%氮酮+2%薄荷油均可以不同程度地促進蒿甲醚軟膏的透皮吸收,其促滲效果順序為2%氮酮+2%薄荷油>2%氮酮+2%冰片>2%薄荷油>2%冰片>2%氮酮。結論:薄荷油單用和復配使用對蒿甲醚的體外透皮吸收均有良好的促進作用,復配使用促透效果更佳。

青蒿;蒿甲醚;氮酮;冰片;薄荷油

青蒿素是我國科學家從中藥青蒿(原植物黃花蒿,ArtemisiaannuaL.)中發現的一種全新的倍半萜內酯結構的化合物,在其基礎上又開發出多種衍生物,如雙氫青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚和青蒿琥酯等,均有良好抗瘧療效[1-2]。蒿甲醚作為一種臨床使用的強效抗瘧藥物,目前多采用口服和肌肉注射給藥,但由于溶解度差,生物利用度低,且體內代謝迅速,臨床需多次給藥才能有效的控制病情,給患者帶來諸多不便[3-5]。近年來,透皮給藥系統或經皮治療系統(Transdermal Therapeutic Systems,TTS)已成為中藥藥劑學科的研究熱點,因其可避免諸如肝首過效應、胃腸道滅活以及口服半衰期短需多次給藥等缺點,并具有長時間維持穩定的血藥濃度或藥理效應、給藥方便等優點[6-8]。本研究擬采用乳化法制備蒿甲醚軟膏,并考察不同種類促滲劑對蒿甲醚體外透皮吸收的影響,為進一步篩選透皮制劑處方做準備,對瘧疾的防治及其他疾病的治療具有重要的意義。

1 材料

1.1 實驗材料 蒿甲醚(梯希愛(上海)化成工業發展有限公司),氮酮、尼泊金乙酯(北京化學試劑公司),冰片(合成龍腦,株洲松本林化有限公司),氯化鈉、三乙醇胺、丙三醇、乙醇(北京現代東方精細化學品有限公司),硬脂酸(北京益利精細化學品有限公司),單硬脂酸甘油酯、蓖麻油(國藥集團化學試劑有限公司),薄荷油(河北安國藥材市場購買),蒸餾水為雙蒸水。雄性ICR小鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司,許可證編號:SCXK(京)2012-0001)。

1.2 儀器 智能透皮試驗儀(YB-P6,天津市富蘭斯電子科貿有限公司),超聲波清洗機(KQ100-VDE型,昆山市超聲儀器有限公司),高效液相色譜(LC-20AT,日本島津公司),十萬分之一電子天平(CPA124S,Sartorius),電子天平(TE1502S,Sartorius),電動脫毛器,手術刀片。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱為Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相為乙腈-水(70∶30),流速為1.0 mL/min,柱溫30 ℃,檢測波長214 nm,進樣20 μL。

2.2 專屬性試驗 按“2.8”項下方法制備不含蒿甲醚的空白軟膏,再按“2.10”項下條件進行試驗,得陰性對照釋放液。分別取蒿甲醚標準品的甲醇溶液,陰性對照溶液及供試品溶液(“2.10”項下釋放液),按照“2.1”項下色譜條件測定。

2.3 標準曲線制備 精密量取ARM標準品10 mg,以甲醇定容至10 mL,作為儲備液(1 mg/mL)。精密量取儲備液,以甲醇為溶劑,逐級稀釋濃度分別為200、100、50、25、10、5、2.5 μg/mL的ARM溶液,按照“2.1”項下色譜條件測定,記錄峰面積。

2.4 線性關系考察 以標準溶液的峰面積(A)對濃度(C,μg/mL)進行線性回歸,得標準曲線線性范圍及相關系數。

2.5 精密度試驗 取濃度分別為100、25、5 μg/mL的蒿甲醚溶液在同1天內連續測5次及連續5 d測定,分別計算日內差、日間差。

2.6 穩定性試驗 取同一供試品溶液分別于0、4、8、12、24 h進樣測定,按照“2.1”項下色譜條件測定,考察樣品穩定性。

2.7 回收率試驗 精密稱取適量蒿甲醚,加入處方量的輔料,配制100、25、5 μg/mL的高、中、低3種濃度的ARM溶液,按照“2.1”項下色譜條件測定,根據標準曲線計算藥物含量,并計算回收率。

2.8 檢測限與最低定量限 配制一定低濃度蒿甲醚溶液,取20 μL注入液相色譜儀,稀釋使蒿甲醚峰高為噪聲的10倍(S/N=10),該濃度為最低定量限(LOQ);繼續稀釋使蒿甲醚峰高為噪聲的3倍(S/N=3),該濃度為檢測限(LOD)。

2.9 蒿甲醚軟膏的制備 稱取蓖麻油30 g、硬脂酸18 g、單硬脂酸甘油酯6 g、蒿甲醚9.4 g置于燒杯內,水浴加熱至75 ℃,作為油相;另取三乙醇胺2.2 mL、甘油15 g、尼泊金乙酯0.092 g、水150 mL置燒杯內,加熱至75 ℃,作為水相,將水相緩緩倒入油相中,邊加邊攪拌,至乳化完全,繼續攪拌直至冷凝,即得均勻細膩含藥空白軟膏。按實驗要求分別取氮酮、冰片、薄荷油加到上述含藥軟膏中,得到含有2%氮酮、2%冰片、2%薄荷油、2%氮酮+2%冰片、2%氮酮+2%薄荷油的5種不同蒿甲醚軟膏。

2.10 滲透試驗用皮膚的處理 按文獻方法制備小鼠皮鼠腹部離體皮膚[9],生理鹽水洗凈,-20 ℃冷藏備用。實驗前自然解凍,并用濾紙吸干后使用。

2.12 統計學方法 所有結果均為平均數±標準差。2組數據之間采用t-test進行統計學分析,多組數據之間采用one-way ANOVA進行統計學分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 方法學評價 按照“2.1”項下色譜條件測定,專屬性實驗結果表明(圖1),蒿甲醚與其他成分能達到基線分離,且陰性對照對測定無干擾。以標準溶液的峰面積(A)對濃度(C,μg/mL)進行線性回歸,得標準曲線,回歸方程為A=678.05×C-1141.7,在2.5～200 μg/mL范圍內線性良好,相關系數R2=0.999 8,符合定量分析要求。日內精密度RSD在0.4%～0.8%之間,日間精密度RSD在1.1%～1.6%之間,符合中華人民共和國藥典的規定。結果表明,樣品供試液在24 h內穩定。回收率實驗結果表明,高、中、低3個濃度水平的平均回收率分別為(99.3±0.2)%、(98.9±0.6)%、(97.5±0.9)%,符合含量測定要求。該系統條件下LOQ與LOD分別為2.5 μg/mL與1.0 μg/mL。

3.2 透皮吸收 蒿甲醚軟膏經鼠皮透皮釋放不同時間累積量見表1。

表1 蒿甲醚軟膏中蒿甲醚的累積透過量

注:-表示未檢測到藥物;與空白組比較,***P<0.001;與2%薄荷油組比較,△△P<0.01,△△△P<0.001

圖1 蒿甲醚HPLC色譜圖

注：A.蒿甲醚標準品;B.陰性對照釋放液;C.供試品溶液;1.蒿甲醚

蒿甲醚軟膏經鼠皮不同時間的累積透過量經線性回歸,直線的斜率即經皮擴散速率Js(μg/cm2·h),回歸方程及相關系數R2見表2。

表2 蒿甲醚軟膏中蒿甲醚的經皮擴散速率

注:與空白組比較,***P<0.001;與2%薄荷油組比較,△△P<0.01,△△△P<0.001

4 討論

蒿甲醚相對分子質量為178,幾乎不溶于水,作為一種強親脂性藥物,其透皮吸收率較低,8 h前未在釋放液檢測到藥物,其24 h累積透過量Q24為(68.14±3.66) μg/cm2,經皮滲透速率Js僅為(2.48±0.11) μg/cm2·h。選擇理想的透皮吸收促進劑增加藥物的吸收,是提高藥物透皮吸收率的首選方法。據文獻報道,氮酮以及天然低毒的中藥促滲劑,如冰片、薄荷油、松節油等對青蒿素類藥物(藥物溶液/混懸液)都具有透皮吸收促進作用[10-11],但未對促滲劑在透皮吸收制劑中的作用開展研究。

氮酮是目前公認的優良促滲劑,其結構由12個碳原子的親脂烷基鏈和環狀內酰氨基團組成,內酰氨基團可以與角質層的脂質雙分子層的極性端相互作用,增加雙分子層的流動性,降低了皮膚對藥物的屏障作用,同時促使水分子進入角質層基底,增加藥物在水性區的溶解度,提高藥物分子擴散能力;而烷基鏈可插入脂質雙分子層的親脂性區域,使其緊密排列變為疏松,降低藥物的擴散阻力[12]。基于其作用原理,氮酮對親水性和親脂性藥物都有滲透促進作用,但也有研究表示氮酮對一些脂溶性藥物無明顯的促進作用,其對親水性藥物的作用強于親脂性藥物[13-14]。本實驗所用蒿甲醚為強脂溶性藥物,氮酮的促滲作用可能受到限制,因此還選用常用的萜(烯)類促滲劑(薄荷油、冰片)作為研究對象。薄荷油和冰片與氮酮具有相似的滲透作用,但由于兩者為親脂性促滲劑,對脂溶性藥物的促吸收作用更強[15]。

實驗結果顯示,單獨使用2%氮酮、2%薄荷油和2%冰片作為促滲劑,1 h時即可從接受液中檢測到藥物,24 h累積透過量Q24和經皮滲透速率Js與不加入促滲劑的空白組比較顯著提高,其促滲效果順序為2%薄荷油>2%冰片>2%氮酮,經皮滲透速率Js分別提高4.72倍、3.59倍和2.17倍。2%薄荷油的透皮吸收效果最為顯著,這與蒿甲醚的強親脂性及3種促滲劑的作用原理有關,薄荷油與本身為萜類結構的蒿甲醚結構相似,在薄荷油與蒿甲醚進入皮膚角質層的親脂性區域后,由于相似相容性和氫鍵作用力等,使得蒿甲醚向角質層中分配的動力增強[15],從而達到更好的透皮吸收效果。

雖然2%氮酮的促滲效果較弱,但將薄荷油和冰片分別與氮酮組成復配體系合用,結果顯示促蒿甲醚軟膏的滲透作用與單獨使用促滲劑比較明顯增強,復配體系對藥物的滲透產生協同作用,可作為復合促滲劑在制劑中使用。本文實驗結果可在蒿甲醚外用制劑的促滲劑選取方面提供參考。此外,促滲劑一般在1%～5%范圍內呈劑量效應關系,為使蒿甲醚透皮達到更好的效果,促透劑使用的最佳濃度及復配體系的比例關系,有待于進一步的研究。

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EffectsofDifferentEnhancersoninVitroTransdermalAbsorptionofArtemetherOintment

Wang Min, Dong Xuerong, Li Jing, Ruan Jiaqi, Gao Linhui, Tu Lichan, Yu Xiaohong

(SchoolofTraditionalChineseMedicine,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

Objective:To investigate the effects of Azone, borneol and peppermint oil on the in vitro transdermal absorption of artemether ointment.MethodsIn an intelligent transdermal test instrument, the cumulative permeating amounts and percutaneous rates of artemether containing different enhancers was determined by HPLC, using the abdominal skin of mice as penetration barrier.Results2% Azone, 2% borneol, 2% peppermint oil, 2% Azone+2% borneol and 2% Azone+2% peppermint oil were found to have different degree penetration enhancing effect, followed successively by 2% Azone+2% peppermint oil>2% Azone+2% borneol>2% peppermint oil>2% borneol>2% Azone.ConclusionUsing peppermint oil alone or with Azone promotes transdermal absorption of artemether significantly and the combination of peppermint oil with Azone has the best penetration enhancing effect.

Artemisia; Artemether; Azone; Borneol; Peppermint oil

北京市自然科學基金項目(7152020)

王敏(1961.11—)女,本科,副主任技師,教師,研究方向:中藥藥劑,E-mail:zhxwanmin@163.com

李靜(1985.10—),女,博士,講師,教師,研究方向:中藥藥劑,E-mail:liyangziyi@ccmu.edu.cn

R284.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.11.058

(2017-05-04收稿 責任編輯：王明)