中藥附子毒效多維評價與整合分析的思路與實踐

彭 成

(成都中醫藥大學藥學院,中藥材標準化教育部重點實驗室,中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地,成都,611137)

專題——中藥“毒、效”整合分析研究

中藥附子毒效多維評價與整合分析的思路與實踐

彭 成

(成都中醫藥大學藥學院,中藥材標準化教育部重點實驗室,中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地,成都,611137)

本文針對中藥安全性、有效性備受質疑的現狀,系統闡述了中藥毒效的認知過程和基本內涵,提出中藥毒效“系統中藥、多維評價、整合分析”的研究思路與方法,并以附子為例,系統研究評價附子毒效在系統中藥中“品種、品質、制藥、藥性、功效、應用”的表現形式,整合分析附子“毒效”的物質基礎、作用機制和增效解毒原理。

附子;毒效;系統中藥;多維評價;整合分析

1 中藥毒效評價與整合分析是中藥學科發展必須面臨和解決的科學問題

安全性、有效性和可控性是藥品的基本屬性,其中安全性和有效性是其核心,簡言之就是藥品的“毒”與“效”是藥品發現、研發和應用的根本。中藥的有效性和安全性不僅是中醫藥傳承和發展的堅實基礎,也是中醫藥服務于世界人民健康事業的根本前提。然而,繼比利時中藥減肥事件、新加坡黃連事件、日本柴胡事件、英國千柏鼻炎片和復方蘆薈膠囊事件、馬兜鈴酸事件、魚腥草注射液事件、何首烏事件之后,中藥材熏硫、漢森制藥“檳榔入藥”、云南白藥與“烏頭堿”、同仁堂多種中成藥含重金屬等成為國內外公眾關注的熱點問題[1-2],中藥的安全性和有效性備受質疑。

面對質疑,科學總結中藥毒性與療效的歷史沿革與研究現狀,多學科交叉融合、整合分析中藥毒效的物質基礎、作用原理、毒效關系,揭示“有故無殞、中病即止”的科學內涵,是關系到我國中藥藥品安全與國際民生的大事。

中醫藥對中藥“毒”“效”的認識源遠流長,內涵非常豐富,是中華民族在長期與疾病作斗爭的醫療實踐和現代藥理毒理研究過程中,逐漸形成的知識和技術體系。我國現存本草文獻中關于中藥毒性、功效理論的記載,最早見于《神農本草經》,用“有毒無毒”來標明藥物的屬性,并將其所載365味藥物,依照有毒無毒、延年益壽及祛邪分為上中下三品,云“下品多毒,不可久服”,如大戟、芫花、甘遂、烏頭、附子、巴豆、狼毒等列入此類,毒性強烈易致死亡。在具體藥物條目下標有“毒性”的文獻,最早見于《吳普本草》,此后歷代本草著作在各藥物條目下,一般都有“有毒”或“無毒”的記載,或按大毒、有毒、小毒或微毒以標注其毒性的大小,以保證用藥安全。但傳統有毒性的中藥,性猛力強,取效甚捷,應用得當,療效卓著,中醫藥對其安全應用有獨到的認識,猶為歷代名醫大師所習用。真正進行中藥“毒”“效”的現代研究,始于19世紀中葉,西方醫藥進入了我國后,老一輩醫藥學家開始應用現代毒理學的理論、技術和方法來研究中藥的毒性、毒作用機制及產生毒作用的物質基礎。尤其近年來,國家高度重視有毒性中藥的研究和應用,先后支持國家自然科學基金項目、國家973計劃等項目100多項,研究涉及傳統有毒性的中藥和現代研究發現有毒性的中藥,如川烏、附子、雷公藤、馬錢子、半夏、大戟、芫花、蟾酥、砒霜、雄黃、朱砂、蒼耳子、黃藥子、關木通、何首烏、補骨脂、馬兜鈴酸、柴胡總皂苷、千里光吡咯里西啶生物堿等,尤其是國家自然科學基金重點項目資助彭成教授進行了“烏頭類有毒中藥安全性研究”,首次建立了“毒性物質基礎-毒作用機制-控毒方法體系”的有毒性中藥安全性評價模式[3];重大研究計劃重點資助上海交通大學陳竺院士進行了“硫化砷與青黛聯合治療白血病的分子機制研究”[4],重點項目資助上海中醫藥大學王崢濤教授進行了“龍膽苦苷對肝毒吡咯里西啶生物堿所致肝損傷的保護作用及其分子機制”[5]。國家重點基礎研究發展計劃(973計劃),資助了中國中醫藥科學院葉祖光研究員負責的“確有療效的有毒中藥科學應用關鍵問題的基礎研究”[6]、南京中醫藥大學段金廒教授負責的“中藥“十八反”配伍理論的關鍵科學問題研究”[7]。國家中醫藥管理局也批準在成都中醫藥大學和中國中醫科學院建立中藥毒理學重點學科;中國中醫藥出版社出版了由彭成教授主編的新世紀創新教材《中藥毒理學》,總結了有毒中藥的最新研究成果[8]。2015年11月13—15日國家自然科學基金委員會在成都主持召開了第149期“雙清論壇”。論壇主題為“中藥‘毒與效’的整合分析”;論壇主席由中國科學院院士、四川大學馮小明教授,中國工程院院士、中國藥科大學王廣基教授、成都中醫藥大學彭成教授和中國人民解放軍第302醫院肖小河研究員共同擔任,與會專家分析研討了本領域的重大科學問題,總結凝煉了未來急需關注與解決的重要基礎科學問題[9]。因此,科學闡釋中藥的毒性與療效,科學總結有毒中藥的應用規律,尤其隨著精準醫學時代的到來、基礎生命科學新技術的滲透和國際毒理學學科的蓬勃發展,揭示中藥“毒”“效”的科學內涵,整合分析有毒性中藥的物質基礎、作用機制、增效減毒原理,闡明有毒性中藥治療疑難重癥的毒效機制,建立風險評估方法、早期預警機制,促進中藥“毒”“效”研究的現代化和國際化,具有重要的現實意義。

2 多維評價與整合分析是破解中藥毒效科學內涵的有效方法

中藥毒效的內涵非常豐富?！岸尽钡暮x主要有3種[10]:1)“毒”就是藥,凡治病之藥皆為毒藥,如《周禮·天官家宰》“醫師掌醫之政令,聚毒藥以供醫事”。2)“毒”指中藥的偏性,如張介賓在《類經·疾病類·五臟病氣法時》中說:藥以治病,以毒為能。所謂毒者,因氣味之偏也,蓋氣味之偏,藥餌之屬也,所以祛人之邪氣。3)“毒”是指中藥的不良反應,如隋·巢元方在《諸病源候論》中提到,“凡藥物云有毒及大毒者,皆能變亂,與人為害,亦能殺人”,張景岳《類經·脈象類》指出“毒藥,謂藥之峻利者”?！靶А奔础肮πА?是指在中醫理論指導下中藥治療作用和保健作用的高度概括[11]。治療功效又可分為消除疾病發生的原因、發揮治本作用的對因治療功效和改善疾病癥狀、發揮治標作用的對癥治療功效,以及對疾病直接發揮治療作用的對病治療功效。1)對因治療作用不外是祛除病邪,消除病因,恢復臟腑功能的協調,糾正陰陽偏盛偏衰的病理現象。簡言之,即祛邪、扶正、調理臟腑功能。2)對癥治療作用是指中藥治療功效中能消除或緩解患者自覺痛苦癥狀或臨床體征的特殊效用。對病治療功效就是針對中醫的“病”發揮治療作用的功效,如截瘧、驅蛔蟲等,分別針對瘧疾、蛔蟲病發揮治療作用。保健功效是在中醫藥理論指導下將中藥對人體預防或養生、康復等作用進行概括和總結而形成的,包括預防功效和養生功效。1)預防功效是指采用以藥物為主的多種手段,如煙熏、洗浴、佩帶或內服等,防止某些疾病的發生和發展。2)養生功效指用中藥以增強人體適應能力,強身健體,調理情志,養護臟腑,延緩衰老等方面的作用。

中藥“毒”“效”的物質基礎復雜多樣,且在不同的病理(病證)狀態下,毒性物質基礎與藥效物質基礎的角色可以發生轉換。中藥“毒性”與“功效”表現復雜多種,且中藥多成分、多靶點、多途徑的作用特點使其毒效機制研究復雜。尤其是在中醫藥長期的臨床實踐中,逐漸形成了依法炮制、對證用藥、合理配伍、控制劑量等增效減毒、增效控毒的方法,屬中醫藥的原創思維,獨具特色和優勢。由此可見,影響中藥“毒與效”的因素很多,即涉及到藥物的因素,又涉及到機體的狀態,還涉及到臨床應用的方式,即“藥物-機體-應用”之間的多維關系。

要科學揭示“毒效”的科學內涵,科學解讀有毒性中藥的“藥物-機體-應用”之間的多維關系,就必須打破傳統的慣性思維和研究方法,按照“系統中藥、多維評價、整合分析”的思路,破解中藥毒效科學內涵。

中藥的毒性與功效是客觀存在的,是中藥的基本屬性,但并不意味著任何中藥,在任何情況下都會對人體造成傷害,引起毒性反應。中藥使用后,是否對人體造成傷害、出現毒性反應,以及毒性的大小,主要與藥物的毒性、機體的狀態和臨床是否合理應用有關。因此,中藥毒效的研究,必須應用“系統中藥”的思維方式,對有毒性中藥的“品、質、制、性、效、用”進行多維評價[12-14],對有毒性中藥的“毒-效”物質基礎-“毒-效”機制-增效減毒原理進行整合分析[9,15],從而揭示中藥“毒”“效”的物質基礎,闡明“毒”“效”物質對機體的作用、作用環節與效應,以及“毒”“效”物質基礎在體內吸收、分布、代謝、排泄的動態變化過程及在不同的病理(病證)狀態下,毒性物質基礎與藥效物質基礎的角色相互轉換的條件、過程、結果;尤其要堅持中醫藥理論特色,多學科交叉合作,在系統毒理學、網絡藥理學指導下,研究評價中藥“藥物(藥材-飲片-組分-成分)-機體(整體-靶器官-靶細胞-靶分子)-應用(道地藥材-依法炮制-制備方法-對證用藥-合理配伍-劑量療程)”等系統關鍵要素的多維關系,整合研究分析減毒增效或控毒增效的理論、技術和臨床實踐,破解中藥“毒-效”研究的難題。

3 附子毒效多維評價與整合分析的思路與實踐

附子的應用歷史悠久,治療效果顯著。早在公元前140年《淮南子》中就有“天雄、烏喙最為兇毒,但良醫以活人”的記載。醫圣張仲景不僅開有毒中藥辨證論治之先河,而且善用附子,每起沉疴,《傷寒論》載方113首,用附子之方達19首,主要用于回陽救逆、散寒止痛、溫陽化氣。明清醫家沿習仲景之法,重用附子,治療頑癥,形成溫陽學派,亦有稱為“扶陽學派”或“火神派”。明代醫家張景岳,將附子列為“藥中四維”,作為治病保命的要藥使用;清代“扶陽學派”的創始人鄭欽安把附子作為“扶陽第一要藥”;“火神派”醫家祝味菊稱附子為“百藥之長”。經系統梳理含附子的方劑信息數據,發現涉及方劑3 915首、病證336種,由附子組成的上市中藥成藥有300多個,即有內服制劑,又有外用制劑、注射劑。但附子的毒性大、不良反應多,使用不當、毒性反應強烈。如漢末《名醫別錄》言:附子“味甘,大熱,有大毒”;李時珍認為“烏附毒藥,非危病不用”;近代名醫惲鐵樵亦云“最有用而最難用者為附子”。而歐州使用烏頭酊劑治療麻木和風濕病較久,且1973年英國藥典已收錄,但很少使用,美國亦如此;而中國、印度、日本、韓國、泰國、尼泊爾等亞州國家使用較為普通,引起中毒的報道較多,故1988年中華人民共和國國務院頒布了第23號令《醫療用毒性藥品管理辦法》,將生附子等28味中藥列為毒性藥品的管理范圍。附子雖然毒性大,但療效卓著,是臨床常用的中藥,歷代主流本草和歷版中國《藥典》都將其收錄。2015年版《中華人民共和國藥典》附子項下收錄鹽附子、黑順片、白附片、淡附片、炮附片,謂其“辛、甘,大熱,有毒。歸心、腎、脾經”,具有“回陽救逆,補火助陽,散寒止痛。用于亡陽虛脫,肢冷脈微,心陽不足,胸痹心痛,虛寒吐瀉,脘腹冷痛,腎陽虛衰,陽痿宮冷,陰寒水腫,陽虛外感,寒濕痹痛”。附子的毒效關系密切,毒性與藥效的靶器官多,主要靶部位一致。要科學揭示附子“毒效”的科學內涵,解讀“藥物-機體-應用”之間的多維關系,就必須按照“系統中藥、多維評價、整合分析”的思路,研究附子毒效的科學內涵。

因此,我們從2000年以來,在國家973計劃課題、國家自然科學基金重點項目、國家“十二五”科技支撐計劃課題、國家發展改革委員會與國家中醫藥管理局“中藥標準化項目”等國家項目的支持下,針對附子種質資源的多樣性、化學成分的復雜性、藥效作用的多向性、臨床應用的廣泛性,以“系統中藥”為指導,提出并建立了“多維評價與整合分析”的方法,對附子的“品、質、制、性、效、用”進行了系統研究,基本闡明了附子不同空間分布、不同采集時間、不同煎煮時間、不同化學層次、不同給藥劑量與效應之間的動態變化過程,基本揭示了中藥附子“毒效”的物質基礎、生物效應和增效控毒原理[16-17]。

品種研究:品種包括藥材品種、炮制品種和中成藥品種。附子為單基原植物,是毛茛科植物烏頭(Aconitum carmichaelii)的子根加工品,有4個亞型;附子的炮制品種有30多個,2015版《中華人民共和國藥典》收載炮制品種5個[18];附子組成的中成藥300多個,常見的有附子理中丸、金匱腎氣丸、參附注射液等。我們項目組對附子的種質資源、遺傳多樣性、轉錄組與主要次生代謝產物、新品種培育、規范化種植、產地加工和主要炮制品、常用中成藥進行了研究。

我們項目組已收集了全國11個省75個縣的烏頭塊根活體標本,在成都中醫藥大學溫江校區已經建立了附子的種質資源庫和種植資源圃;研究了附子種質資源的染色體倍性遺傳變異特性和烏頭類多倍體形成機制,發現了存在不同染色體數量的附子資源類型,探討了附子種質資源遺傳多樣性形成、變化的機制和特點;研究了附子植株生長周期內各主要器官的發生特點、生物量變化和物質累積動態規律,根、莖、葉、花、果發育建成的關鍵階段,建立了主要性狀生物量的生長曲線;揭示了生態因子、豐產技術與附子產量構成、藥效物質的動態變化規律。尤其我們利用目前已收集到的烏頭基因組DNA樣本,使用第3代遺傳標記技術——單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNPs)[19],進行PCR擴增與核苷酸SNP測序,分析SNP頻率、分布與特征,并構建了烏頭種質遺傳進化樹。為探索附子植株的生物堿類次級代謝產物的合成途徑以及基因調控信息,我們針對附子全植株進行了無基因組參考序列的RNA-Seq掃描測序及相應分析。使用烏頭的子根(Lateral Root)、主根(Parent Root)、莖干(Stem)、葉片(Leaf)、全花(Flower)、全果(Fruit)等6個器官組織為材料,進行總RNA提取,通過Illumina Hiseq 2000平臺進行RNA-Seq測序,總計產出2.357 29 e+10 nt數據。組裝結果總Unigene 133 742個,總長129 872 479 nt,平均長度971 nt,N50達到1 576 nt。在烏頭轉錄組的基因注釋分析中,我們比較關注與生物堿的生物合成代謝相關的次生代謝通路及基因調控,主要是萜類、生物堿類、苯丙烷等代謝通路。通過KEGG分析,我們獲得約1 500條與萜類代謝、2 800條生物堿與苯丙烷類代謝相關的核苷酸序列(圖1)。我們利用烏頭轉錄組數據,正逐步開展深入的信息挖掘,如將烏頭地下部分根器官與地上部位器官進行代謝通路的比較分析,發現了4個與植物真菌感染相關的基因的轉錄表達活性發生了顯著性差異、26個植物適應生境條件相關的信號轉運與激素信號傳導相關的基因發生了轉錄活性顯著性差異(圖2),這些經過篩選出的差異基因都具有極大的深入研究意義。

圖1 主要次生代謝通路的核苷酸序列數量統計

注：A:Metabolism of terpenoids and polyketides;B:Biosynthesis of other secondary metabolites

圖2 烏頭地下地上部位轉錄組差異基因的代謝通路分析

我們研究了附子鵝掌葉、艾葉、南瓜葉泡桿、南瓜葉鐵桿4個亞型的物質基礎和生物效應,證明各亞型均可入藥的科學依據;項目組先后培育附子新品種3個,其中川附2號、391-1因產量高、活性成分高、抗病性好,獲得新品種證書,并由華潤三九雅安藥業與四川好醫生藥業在四川江油與四川布拖進行了規范化種植,并獲得國家GAP認證;產地加工和炮制方面,首次制定了膽巴的輔料標準,對鹽附子、黑順片、白附片、淡附片、刨附片、炮天雄等炮制品種的炮制方法和增效解毒原理進行了研究,結果,黑順片、白附片、淡附片、黃附片等毒性明顯降低,刨附片、炮天雄幾乎沒有毒性;附子理中丸、金匱腎氣丸等常用中成藥,按傳統方法制備后,毒性小、療效好。

品質研究:品質即指中藥固有的整體特性的質量,包括外在品質和內在品質兩部分。附子不同的炮制品種,其外在品質不同,如鹽附子以個大、體重、色灰黑、表面起鹽霜者為佳,黑順片以皮黑褐、切面油潤有光澤者為佳,白附片以片大、色黃白、油潤半透明者為佳,淡附片以氣微,味淡,口嘗無麻舌感。以切面油潤有光澤者為佳。內在品質,主要包含遺傳物質和藥效物質。我們應用RAPD分子標記技術,研究了附子資源群體的遺傳多樣性,繪制了附子種質資源的指紋圖譜;應用IR、TLC、HPLC、GC、CE、UV、HPLC-MS、GC-MS等現代技術,建立了附子藥材、飲片、標準提取物、組分的化學庫和指紋譜;比較研究了附子不同產地、不同炮制品、不同配伍藥對、不同煎煮時間、不同提取環境毒效成分的變化,從而建立了附子在不同狀態下的化學庫和指紋譜;應用量子化學理論和Hyperchem結構分析軟件,研究了烏頭堿的熱力學過程和構效關系,揭示了附子的物質基礎和動態變化過程。結果,附子主要含生物堿、多糖、黃酮、芳香酸、甾醇、微量元素等。生物堿是目前附子中研究最多的化學成分,也是附子中較為特征的成分,主要包括C19型二萜生物堿類、C20型二萜生物堿類、酰胺類、季銨鹽類、阿樸啡類等,C19型二萜生物堿數量最多,也一直被認為是附子的有效成分和毒性成分,《中華人民共和國藥典》2015版規定了6種C19型二萜生物堿的檢查和含量測定,分別為烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭堿和苯甲酰新烏頭堿[18];我們從附子中分離了11個非二萜生物堿,主要包括嘧啶、吡啶、腺苷、吡咯和酰胺類[20-22]?，F代研究,烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿是附子的主要毒性成分;去甲烏藥堿、去甲豬毛菜堿、棍掌堿氯化物、附子靈、尼奧林、尿嘧啶、腺苷等具有強心作用;烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、去氧烏頭堿等具有鎮痛作用;附子多糖FPS-1等具有增強免疫功能的作用[23]。我們也比較研究了四川、陜西、云南、湖北等產地附子的指紋圖譜,發現江油附子特有的指紋峰(見圖3),證實道地藥材的科學性。

圖3 江油附子特有的指紋圖譜

制藥研究:主要包括藥材產地加工、飲片炮制、提取工藝、制劑工藝、自動化生產等制藥過程。我們以參附注射液為例,來闡述制藥研究的主要環節[24]。1)產地加工與飲片炮制:附子的產地加工是降低附子毒性的重要手段之一,其傳統加工中強調膽巴浸泡,膽巴的質量直接影響附子藥材的質量,我們制定了膽巴的質量標準。參附注射液以黑順片入藥,我們對黑順片的炮制工藝過程中膽巴浸泡、漂洗次數、蒸煮處理等每個工藝步驟的總生物堿、雙酯型生物堿、單酯型生物堿、核苷類物質(尿苷、腺苷)、糖類物質(果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖)、無機鹽離子、浸出物、灰分等指標的變化規律進行了研究,制訂了黑順片炮制工藝及工藝技術參數,既能保證附片的減毒存效,又能保證中藥注射劑的質量。紅參產地加工與炮制,即選好的參根剪去須根及支根,裝入蒸籠中蒸2～3 min,先武火后文火,蒸至參根呈半透明時熄火,冷后取出曬干或烘干,我們項目組建立了鑒定紅參藥材的TLC法和近紅外光譜法和人參皂苷、糖蛋白等成分含量測定方法,并建立了紅參內控標準的指紋圖譜。2)提取與制劑工藝研究:黑順片的提取工藝是關系到參附注射液安全有效的重要因素。我們采用UV、HPLC、HPLC/MS、HPLC/ELSD等分析方法,深入研究黑順片提取工藝中煎煮時間、煎煮次數、加水量等因素變化過程中水提液總生物堿、酯型生物堿和雙酯型生物堿的量時曲線,在組分水平和分子水平上探討煎煮時間、加水量對黑順片化學成分譜(庫)的生物堿成分及毒性關系,黑順片成分與功效關系,揭示了傳統水煎對黑順片毒性成分的控制規律;通過黑順片生物堿成分模擬水解分析,確定毒性成分的水解影響因素、水解產物和黑順片提取的最佳時間。對紅參提取時回流加醇時間、乙醇濃度、回流升溫時間、冷卻時間,各次回流液的醇度、體積,對濃縮時的蒸汽壓力、真空度、濃縮時間、濃縮液的相對密度及溫度,以及主要階段的蛋白質、樹脂、鞣質、草酸鹽、鉀離子、含量、熱原、指紋圖譜、微生物數及部分階段的溶血、異常毒性進行研究,確定紅參提取工藝。對參附注射液工藝中除淀粉、蛋白質、鞣質、樹脂等高分子物質和除熱原、滅菌工藝、內包材等進行研究,建立產品各階段藥物含量、指紋圖譜等方面的質量控制方法。3)自動化生產與在線檢測:應用網絡控制技術、中藥指紋圖譜質量控制和近紅外在線檢測等技術,對參附注射液的生產自動控制系統的主要設備和主要技術參數進行研究,對工藝參數進行實時在線存儲、傳輸、備份和反饋,通過紅外在線自動監測儀和軟系統對參附注射液生產線的監控點實現遠程在線控制。

藥性研究:藥性是中藥作用于機體的基本性質和特征的高度概括,是中藥基本理論的核心,是中藥區別于植物藥和天然藥物的顯著標志。本項目根據附子辛、甘、大熱,歸心、腎、脾經,有毒的藥性特點,進行了系統研究。結果:附子總生物堿可能是附子熱性的主要有效組分,附子辛、甘、大熱的藥性,通過強心、溫陽、抗炎、鎮痛、散寒的生物效應得以表述;附子歸心、腎、脾經,通過附子治療陽虛心力衰竭大鼠、腎陽虛證小鼠、脾陽虛便秘大鼠和小鼠等動物模型得以證明;附子的毒性通過附子的基礎毒性與毒作用機制研究得到證實。尤其我們按照國際ICH的規范,在GLP實驗室,先后完成了附子、白附片、黑順片、生川烏、制川烏、提取物或提取部位對正常動物或病證模型動物的急性毒性試驗、長期毒性試驗、安全藥理試驗、致突變試驗和生殖毒性試驗[25-26];應用全胚胎培養、細胞培養、流式細胞技術、膜片鉗技術、基因芯片技術、慧星試驗、放射配基結合分析、超微結構觀察和放射免疫測定等方法,研究附子、川烏和附子、川烏的主要毒性成分烏頭堿的毒作用機制;應用HPLC/MS/MS、GC/MS、HPLC/ELSD等分析技術,建立了烏頭堿、新烏堿、次烏頭堿在組織、血清、膽汁、尿液中化學成分測定方法及其代謝物的檢測方法,進行了川烏、附子中生物堿的毒代動力學研究[27];尤其應用高內涵篩選分析附子及其成分對斑馬魚和原代或傳代細胞[28]的毒性靶器官、靶細胞,發現:1)附子、川烏的有毒組分主要為酯性生物堿(烏頭堿),毒性靶器官主要是心臟、神經、胚胎(見圖4)。2)附子、川烏存在控毒組分,為水溶性生物堿和多糖,可以對抗酯性生物堿的毒性。3)細胞離子通道、亞結構、酶、受體等是烏頭堿毒作用的靶點,其毒作用具量效、時效關系。

功效研究:功效是系統中藥的核心和主體,是系統中藥學區別于傳統主流本草學、現代藥理學的重要特征,是現代中藥學的學科標志。我們根據附子回陽救逆、補火助陽、祛風除濕止痛的功效,先后創建了心陽虛心力衰竭、陽虛便秘、風寒濕痹動物模型,建立了腎陽虛證、痛證、炎證、虛寒證動物模型和心肌細胞、神經細胞、結腸間質細胞、生殖細胞模型,研究附子的功效作用。結果,附子能明顯增加心陽虛衰大鼠心率,升高左室內壓最大上升速率,降低左室內壓最大下降速率;明顯改善腎陽虛動物一般狀態,升高體溫,恢復體溫晝夜節律性,顯著延長腎陽虛動物低溫游泳衰竭時間和爬桿時間;明顯改善陽虛便秘小鼠和大鼠的陽虛便秘癥狀,顯著縮短排便潛伏期,增加排便顆粒數,明顯促進胃腸蠕動,提高胃腸推進率[29];能有效治療風寒濕痹動物模型,能明顯抑制二甲苯所致小鼠耳郭腫脹,顯著對抗蛋清所致大鼠足跖腫脹,抑制巴豆油所致大鼠炎性肉芽腫的增生,減少炎性滲出液;能顯著減少醋酸所致小鼠扭體次數,延長小鼠扭體潛伏期,明顯延長熱板刺激小鼠添后足潛伏期,提高熱板小鼠痛閾值;并通過不同結構層次發揮功效機制。尤其,我們根據附子對證用藥的規律,研究了不同炮制品種(生附子、鹽附子、白附片、黑附片、生川烏、制川烏、刨附片、炮天雄)[30]、不同煎煮時間(15 min、30 min、60 min、120 min、3 h、4 h、6 h)、不同給藥劑量(相當于臨床人用量3 g/60 kg/d的1、3、6、12、24、36、48、72、96、120倍)[31]、不同配伍藥對(附子配伍甘草、干姜、大黃、人參、厚樸、黃連,制川烏配伍白芍)增效解毒的機制[17]。結果:1)附子的主要藥效靶器官是心臟、神經、胚胎。2)生附子、生川烏煎煮時間短、劑量大,毒性強;煎煮時間長、劑量小,毒性低;煎煮時間達6 h,無明顯毒性。附子、川烏炮制后,毒性明顯降低;刨附片、炮天雄幾乎無毒[32]。附子配伍甘草、干姜、大黃、人參、厚樸、黃連,制川烏配伍白芍,具有明顯的增效解毒作用。

圖4 烏頭堿毒性對心臟、神經、胚胎的作用

應用研究:中藥臨床應用主要包括配伍、用法、用量、使用注意等方面的內容。本項目組在中醫藥理論指導下,主要系統研究了附子正品藥材、依法炮制、對證用藥、合理配伍和不同給藥劑量、煎煮時間對化學物質、毒性反應、藥效作用的影響,為臨床安全合理用藥提供了科學依據。1)正品藥材:項目組應用現代藥學技術建立了附子的化學庫、指紋譜和煎煮系統中酯型生物堿含量的變化,選擇正常動物和病證動物模型,比較研究了不同來源品種藥材在發揮解熱、抗炎、鎮痛和溫陽功效時的毒性和藥效作用[33],以及對體外原代心肌細胞、海馬神經元細胞的毒效強度,結果顯示,品種不同,其毒效物質基礎和強度存在差異,以正品藥材、道地產區藥材質優效佳。2)依法炮制:項目組應用現代藥學技術建立了附子不同炮制品的化學庫、指紋譜,選擇正常動物及炎性反應動物模型、疼痛動物模型[34]、痹證動物模型、寒證動物模型、心力衰竭動物模型、陽虛便秘動物模型,研究了不同炮制品增效減毒的作用及作用原理。結果,炮制具有明顯的減毒作用。3)對證用藥:項目組從附子的功效特點出發,選用小鼠耳郭腫脹模型、大鼠足跖腫脹模型、大鼠肉芽腫模型、疼痛動物模型、寒證動物模型、痹證動物模型、心力衰竭動物模型、陽虛便秘動物模型、熱證動物模型,研究生附子、黑順片、白附片等對不同病證模型的毒性和藥效,通過正交設計得到不同的優化配比,結果發現,對證用藥能控毒增效。4)合理配伍:從附子的臨床應用出發,選擇常用藥對附子(鹽附子、黑順片、白附片)配伍干姜、甘草、大黃、人參,從飲片配伍、組分配伍和成分配伍3個層次,一方面采用藥學檢測技術方法,研究了配伍前后對附子總生物堿、酯型生物堿和雙酯型生物堿含量的變化,另一方面,選用炎性反應動物模型、疼痛動物模型、痹證動物模型、寒證動物模型、心力衰竭動物模型、陽虛便秘動物模型,研究附子配甘草、附子配干姜、附子配人參、附子配大黃的解毒增效作用原理,篩選其有效組分、毒性組分、控毒組分,以及各組分配伍的最佳比例。結果發現,附子存在毒性組分和控毒組分,通過配伍,可以減少毒性組分的含量,降低毒性,且增加療效。并通過此研究發現了治療心力衰竭、便秘、類風濕關節炎的有效組分和有效組分最佳配伍比例。5)延長煎煮時間:通過比較不同煎煮時間下附子總生物堿、酯型生物堿和雙酯型生物堿的含量變化和烏頭堿的水解規律,應用炎性反應動物模型、疼痛動物模型、痹證動物模型、寒證動物模型、心力衰竭動物模型、陽虛動物模型,觀察不同煎煮時間、不同給藥劑量下的毒性和藥效,結果發現,附子可通過延長煎煮時間降低毒性,也證實了此類中藥在傳統應用中“先煎”“久煎”的科學性。

我們通過對附子毒效的多維(品質制性效用)評價和組學(基因組、蛋白組、代謝組、細胞組)研究,發現:1)附子毒效關系密切,主要毒性靶器官和藥效靶部位為心臟、神經、胚胎;2)附子存在毒效相反的兩類物質,一類為毒性物質——二萜類生物堿等,另一類為藥效物質——非二萜類生物堿成分。附子的毒性物質基礎與藥效物質基礎在不同的狀態下是可以發生轉化的,如二萜類生物堿是毒性物質基礎,但發揮抗炎止痛作用時,又是藥效物質基礎,二萜類生物堿水解后又可轉換為藥效物質。3)附子不同的產地、不同的炮制品種、不同的制備方法、不同的配伍方式,針對機體不同的疾病狀態,不同的靶器官、靶細胞、靶分子,其物質基礎和毒效作用機制是不同的,“附子-機體-應用”之間具有復雜的網絡關系。

網絡藥理學、系統毒理學和組學是目前解析復雜網絡的思路和方法,為附子的多維關系的整合分析提供了有效的途徑。我們進一步研究的思路是:應用網絡藥理學、系統毒理學和組學等多學科的技術和手段,整合研究附子“藥物(藥材-飲片-組分-成分)-機體(整體-靶器官-靶細胞-靶分子)-應用(道地藥材-依法炮制-制備方法-對證用藥-合理配伍-劑量療程)”的多維關系,揭示附子的“毒效物質基礎-毒效作用機制-控毒增效原理”,明確附子的閾劑量、半數有效劑量、半數致死劑量、毒作用帶、治療指數和安全限度,破解中藥“毒-效”研究的難題,為中藥“毒-效”多維評價和整合分析研究提供示范。見圖5。

圖5 附子“毒-效”多維評價和整合分析研究示意圖

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ThoughtandPracticeofMultidimensionalEvaluationandIntegratedAnalysisonToxicityandEfficacyofRadixAconitiLateralisPraeparata

Peng Cheng

(CollegeofPharmacy,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine;KeyLaboratoryofChineseHerbsStandardizationofMinistryofEducation;Co-constructKeyLaboratoryofSystematicResearch,DevelopmentandUtilizationofChineseMedicinalResources,Chengdu611137,China)

Currently, the safety and efficacy of Chinese materia medica have been questioned. Encountering that situation, this paper systematically elaborated on the cognitive process and basic connotation of the toxicity and efficacy of Chinese materia medica. A new thought and methodology of “multidimensional evaluation and integrative analysis of the toxicity and efficacy of TCM” was proposed. Taking Radix Aconiti Lateralis Praeparata as an example, the breeds, quality, pharmaceutical manufacture, medicinal properties, medicinal effects, and application of Radix Aconiti Lateralis Praeparata were used to evaluate the toxicity and efficacy systematically. Furthermore, the material basis, mechanism, and principle of effect-enhancing and toxicity-reducing of Radix Aconiti Lateralis Praeparata were integrated analyzed.

Radix Aconiti Lateralis Praeparata; Toxicity and efficacy; Multidimensional evaluation; Integrated analysis

國家自然科學基金重點項目(81630101);國家發改委標準化項目(ZYBZH-C-SC-51);國家自然科學基金國家基礎科學人才培養基金(J1310034);四川省中醫藥管理局“川產道地藥材綜合開發與區域發展”項目(2016ZY008)

彭成(1964.03—),男,博士,教授,博士研究生導師,研究方向：中藥毒效的系統評價與整合研究,E-mail:pengchengchengdu@126.com

R285.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.11.001

(2017-10-09收稿 責任編輯：王明)