原發性卵巢功能不全小鼠卵巢血流與性激素濃度相關性研究

馮遜遜 董曉英 鄭秀蕊

(1.首都醫科大學基礎醫學院，北京 100069;2.首都醫科大學中醫藥學院，北京 100069)

·基礎研究·

原發性卵巢功能不全小鼠卵巢血流與性激素濃度相關性研究

馮遜遜1董曉英2*鄭秀蕊1

(1.首都醫科大學基礎醫學院，北京 100069;2.首都醫科大學中醫藥學院，北京 100069)

目的研究原發性卵巢功能不全(primary ovarian insufficiency，POI)小鼠卵巢的血流動力學與性激素濃度的相關性。方法以小鼠透明帶3作為抗原，皮下多點注射，免疫BALB/C雌性小鼠建立原發性卵巢功能不全模型，利用超聲動態觀察卵巢的形態，同時利用超聲彩色多普勒成像觀察卵巢的血流變化，最后取小鼠血清進行性激素濃度檢測。結果超聲下可觀察到模型組小鼠卵巢體積減小，卵泡數目減少，血流分布較弱。與空白組小鼠相比較，模型組小鼠阻力指數 (resistive index，RI)較高，搏動指數(pulsatility index，PI，PI=S-D/Vmean)較低，脈壓差(pulse pressure，PP)呈升高趨勢；與空白組小鼠相比較，模型組小鼠的促卵泡生長激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)均差異有統計學意義(P<0.05)。進一步通過模型組小鼠血流動力學與激素濃度相關性檢驗，發現模型組小鼠PP與FSH有一定(P<0.05)。結論POI小鼠血流動力學PP與血清學FSH濃度有顯著相關性，本研究為動態觀察POI治療過程提供參考。

原發性卵巢功能不全；超聲血流；動態；性激素；相關性

原發性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)是指卵巢不全所導致的40歲之前或者更早即出現高促性腺激素性閉經的現象[1]。特點是原發或繼發閉經伴隨血促性腺激素濃度升高和雌激素濃度降低[2]，包含卵巢內卵泡功能障礙或原始卵泡耗竭兩個過程。近年來POI發病率有所增高[3]，引起了廣泛關注。超聲動態監測卵巢變化及卵泡發育在POI臨床治療中扮演著重要的角色。相關研究[4]顯示，卵泡發育與激素濃度具有相關性，臨床通常應用超聲檢測卵泡發育并對POI的治療效果進行評價。隨著小動物超聲系統在基礎研究中的廣泛開展，源于臨床的超聲方法可用于基礎研究，從而進一步探究疾病發生機制，為發現臨床中問題的特點奠定基礎。本研究是將正常小鼠轉變為免疫性原發性卵巢功能不全的模型，通過超聲動態觀察模型組與空白組小鼠的卵巢形態及血流動力學指標，檢測血清學激素濃度并對兩者進行相關性研究，為后續的實驗提供一個新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級BABL/c雌性小鼠20只，7～8 周齡，體質量18～22 g，由北京維通利華實驗動物中心提供，實驗動物合格證號: SCXK(京)2012-0001。

1.2 試劑

小鼠透明帶多肽溶液：根據小鼠透明帶3(zone pellucida 3，ZP3)的第330～342個氨基酸序列 (NSSSSQFQIHGPR)，合成透明帶多肽，其分析純度>90%，杭州多肽生化有限公司生產；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，美國Sigma公司產品。

1.3 實驗儀器

應用超高分辨率小動物彩色多普勒超聲成像系統(Vevo 2100 Imaging System,Fujifilm Visual Sonics Inc,美國)，MS-550D(700D)高頻寬帶電子線陣探頭。探頭中心頻率40 MHz，最高分辨率40 μm；軸向分辨力和橫向分辨力分別為40 μm和90 μm；采集深度11 mm，增益25 dB。

1.4 免疫性POI小鼠模型建立

雌性小鼠均經陰道脫落細胞涂片篩查，性周期正常。將20只小鼠數字表法隨機分組，10只做為空白組，其余10只用于造模。稱取 6 mg ZP3 透明帶多肽粉末，加入 6 mL 雙蒸水配成溶液，與弗氏完全佐劑按1∶1比例配制成免疫試劑，與弗氏不完全佐劑按1∶1比例制成免疫強化試劑。參考文獻[5]每鼠予0.15 mL 免疫試劑多點注射到腹腔皮下，14 d后以免疫強化試劑0.15 mL再次多點注射到小鼠腹腔皮下加強免疫。空白組每次造模時每只小鼠予以0.15 mL 0.9%(質量分數)氯化鈉注射液注射到腹腔皮下。注射完成后，造模1周后使用瑞士染色法進行陰道涂片觀察。每周需觀察小鼠腹部的腫脹情況，以判斷造模試劑的吸收情況。

1.5 高頻率小動物超聲系統動態觀察

1)動物麻醉及準備：操作前使用脫毛膏(NAIR，加拿大)脫去小鼠腰背部探頭掃描區域的被毛，將小鼠放入麻醉誘導箱，調節氧氣至1 L/min，調節異氟烷至2.5%。麻醉后將小鼠取出，俯臥綁定于小鼠專用操作臺，四肢連接電極，固定并維持超聲平臺溫度40 ℃，用麻醉面罩罩住小鼠的口鼻部，并調節異氟烷的維持量為1.0%～1.5%持續予吸入。在小鼠被毛區涂適量超聲耦合劑，避免對檢查部位施加壓力。

2)超聲探頭定位及二維超聲成像：探頭首先置于小鼠右側背外側上方2～3 mm處，探頭切跡朝向小鼠頭側，調節專用操作臺的微調旋鈕，使平臺從頭部向尾部移動，直至右側卵巢可見，并使腎臟作為標志位于卵巢的頭側。通過調節最佳增益和增益補償設置獲得滿意的卵巢縱軸切面二維超聲圖像。轉動微調旋鈕，保存整個右側卵巢的圖像動態視頻(300幀/10 s圖像動態視頻)。將探頭旋轉90°，獲得卵巢橫軸切面二維超聲圖像并保存，使用同樣的方法保存左側卵巢的圖像動態視頻。

3)超聲采集卵巢血流圖像：將彩色取樣框置于卵巢上，調節入射角，顯示卵巢間質動脈，觀察卵巢基質內的動脈血流，用脈沖多普勒顯示其頻譜，得到滿意頻譜后連續記錄3～5個心動周期，記錄卵巢間質動脈峰值流速(peak systolic velocity，PSV) 和阻力指數(resistive index，RI) 并保存圖像。

1.6 取血

6周后采用心臟穿刺取血，處死動物，將小鼠血液標本靜置，3 000 r/min離心，用移液器取血清。

1.7 高頻小動物超聲系統動態觀察

1)卵巢面積及卵泡數目：在超聲影像工作站對所獲卵巢圖像進行離線測量分析。二維圖像：于長軸切面測量卵巢的縱徑和前后徑，短軸切面測量卵巢的橫徑和前后徑；根據假設卵巢為橢圓體并按照橢圓體公式計算卵巢面積：卵巢面積(cm2)=縱徑×橫徑；控制所獲取的左右卵巢的圖像動態視頻一幀一幀回放，保存每一幀圖像并計數卵泡個數及測量卵泡直徑。根據每一次采集卵巢連續切面圖像中卵泡個數，計算最大切面下最大竇卵泡數。

2)觀察卵巢血流和血阻的測量：在超聲影像工作站中采集小鼠卵巢血流圖像，停幀測量收縮期最大血流速度(Vmax)、舒張期最低血流速度(Vmin),儀器自動求出脈壓差(pulse pressure，PP,即平均收縮壓減平均舒張壓)、阻力指數(RI=S-D/S)及搏動指數(pulsatility index，PI，PI=S-D/Vmean)。

1.8 放射免疫法檢測

采用放免試劑盒，按照試劑盒說明書操作要求測定小鼠血清雌激素(estrogen，E2)、促卵泡生長激素(follicle-stimulating hormone，FSH)、促黃體生成素(luteinizing hormone，H)、黃體酮(progesterone，P)和抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)激素濃度。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 小鼠陰道涂片觀察

觀察空白組和模型組小鼠的陰道涂片，可觀察到空白組小鼠動情周期正常，模型組小鼠動情周期發生紊亂。肉眼觀察可見空白組小鼠陰道分泌物黏稠呈拉絲狀，模型組小鼠陰道分泌物較為稀薄。鏡下可見，空白組小鼠動情期細胞較為均質，角化上皮細胞呈落葉狀堆積；模型組小鼠動情周期紊亂，動情期細胞不均質，有多種細胞混雜，如角化上皮細胞，白細胞和淋巴細胞等(圖1)。

2.2 超聲動態觀察

2.2.1 小鼠卵巢形態觀察

在每周的動態觀察中，發現空白組小鼠卵巢面積變化不大，卵泡較為均勻分布在皮質周圍。模型組小鼠的卵巢體積自第2周起逐漸變小，由于伴隨著卵泡數量的減少，卵泡的分布也較為稀少(圖2)。

2.2.2 超聲多普勒觀察小鼠卵巢血流

在連續每周的動態觀察中，發現空白組小鼠卵巢血流變化不大，空白組小鼠血流豐富，由第2周到第6周基本維持在同一水平。模型組小鼠由第2周到第6周血流持續減少(圖3)。

圖1 陰道涂片Fig.1 Smears of vaginal

圖2 卵巢形態Fig.2 Morphology of ovary

A：Ovarian morphology of blank group mice in the first week and the ovarian follicle around the cortex was represented by the arrow；B：ovarian morphology of blank group mice in the sixth week；C：ovarian morphology of model group mice in the first week；D：ovarian morphology of blank group mice in the sixth week.

圖3 多普勒血流Fig.1 Doppler blood flow

A：blood distribution of blank group mice in the first week；B：blood distribution of blank group mice in the sixth week；C：blood distribution of model group mice in the first week；D：blood distribution of model group mice in the sixth week.

2.2.3 超聲血流數據動態變化圖

在連續每周的動態觀察中，可測得空白組和模型組小鼠的脈壓差、阻力指數和搏動指數的數值，每組取均值后，按照周為橫坐標，數值為縱坐標得到血流動力學數據的動態圖。由動態圖觀察到，空白組脈壓差維持在低水平的動態平衡，模型組脈壓差呈高水平上升趨勢；空白組的RI基本保持在穩定的波動范圍內，模型組RI值高于空白組；空白組PI維持在較高水平的動態平衡，模型組的PI呈下降趨勢(圖4)。

*PP A is the PP of model group and PP B is the PP of blank group.RI A is the RI of model group and RI B is the RI of blank group.PI A is the PI of model group and PI B is the PI of blank group;SBP:systolic blood pressure;DBP:diastolic blood pressure;RI:resistive index;PP:pulse pressure;PI:pulsatility index；△1 mmHg=0.133 kPa.

2.3 血清學激素濃度

2.3.1 血清學檢測數據統計

通過ANOVA 方法分析，與空白組相比較，模型組的 FSH、AMH差異均有統計學意義(P<0.05)，造模成功；與空白組相比，模型組的E2、LH、P差異無統計學意義(P>0.05)，但E2及FSH呈現下降趨勢，詳見表1。

2.3.2 血清學數據相關性分析

對最后1周的模型組小鼠血清學激素濃度與其卵巢血流動力學數據進行相關性分析，得到FSH與PP相關性差異有統計學意義(P=0.045，r=0.642)，兩者之間有一定的相關性。PI與FSH，PP與PI之間相關性差異無統計學意義(P>0.05)(圖5)。

表1 兩組小鼠血清E2、FSH、LH、P、AMH濃度比較Tab.1 Content of E2，FSH，LH，P，AMH between two groups (，n=10)

**P<0.01vscontrol group;E2:estradiol in serum;FSH:follicle-stimulating hormone；LH:luteinizing hormone;P:progestational hormone;AMH:anti-Müllerian hormone.

圖5 模型組小鼠FSH與PP相關性散點圖Fig.5 Scatter plot of correlation between FSH and PP in model group mice

FSH:follicle-stimulating hormone；PP：pulse pressure；△1 mmHg=0.133 kPa.

3 討論

超聲檢測小鼠卵巢形態和超聲多普勒檢測小鼠卵巢血流可以在短時間內較為明顯地動態觀察卵巢的形態的變化和血流的改變，并且可以動態監測卵巢的各項指標的變化。形態相關學指標包括卵巢面積、直徑、卵泡個數和分布；血流指標包括RI、PI和PP。

形態相關指標可直觀反映小鼠卵巢的變化，表現在卵巢面積變化和卵泡數目的增減。血流指標中，RI反映的是血管順應性的大小，血管的順應性降低，從而增加RI，血流受阻[6]。PI反映著血管對血液搏出能力的衡量，不僅取決于收縮期峰值流速(peak systolic velocity，PSV)和舒張末期血流速度(end diastolic velocity，EDV)，還與一個心動周期的平均流速有關[7]。PP是平均動脈壓與平均靜脈壓的差值，反映著血管彈性與血管功能的一個指標。PP下降意味著血管彈性的下降，由于大動脈彈性減退使脈搏波傳導速度增快，使得反射波抵達中心動脈的時相由舒張期變為收縮期，從而導致收縮壓升高，舒張壓降低，PP增大[8-9]。

POI小鼠卵巢分泌E2、P減少，造成對垂體FSH、LH的抑制減弱，導致血清FSH、LH濃度升高，引起卵泡數目急劇減少。FSH升高是卵巢功能減退引起的最早的激素變化，臨床上FSH值高于40 IU/L。而高FSH同時伴有高LH,則標志著卵巢衰竭[10]。近年來發現，AMH具有調控卵泡生長和發育的作用[11]，是評價卵巢儲備功能的敏感指標，故可將AMH定義為卵巢功能下降的指標[12]。

本研究通過超聲動態觀察小鼠卵巢的形態，可觀察到POI小鼠卵巢面積發生改變，說明POI小鼠卵巢受到造模試劑的影響，其正常發育受到抑制。通過超聲彩色多普勒成像可觀察到，模型組的血流明顯減少，說明POI小鼠的血流減弱，卵巢維持自身血供能力下降。PP的增加與小鼠年齡、性別和心率等有著密切的關系，反應的是模型組搏出量提高或順應性降低。綜合血流動力學結果的動態變化圖，在統計學結果假陽性，沒有重復測量方差分析的前提下，可初步推測模型組卵巢血管順應性降低，血管彈性下降，進而導致卵巢功能的下降，致使卵巢血流量的減少。

相關性散點圖直觀顯示模型組小鼠FSH與PP值呈正相關，提示FSH可能通過不同的途徑來影響PP的變化。從神經-體液的角度，由垂體前葉嗜堿性細胞分泌的FSH可能通過體液運輸，作用于卵巢血管上皮細胞，造成上皮細胞性質的改變，對血管的順應性產生一定的影響，進而影響到血流，對PP造成影響。從分子的角度，FSH可能影響到了血管上皮細胞內的蛋白表達或者影響到了細胞內的某些信號通路，使上皮細胞產生生理性變化，進而影響到血流的變化，從而對PP造成影響，使PP發生相應變化。其他血流動力學數值與血清學激素數值經檢驗差異無統計學意義(P>0.05)，可能是由于樣本量相對較少以及兩個指數對PP的影響所造成。雖然RI和PI值在相關性檢驗結果上與FSH無相關性，但兩者在兩組之間呈現不同的趨勢，可能是以PP的形式與FSH呈相關性，進而說明PP更能說明血流動力學與激素濃度的聯系。

綜上所述，繼往相關性研究均采用離體實驗方法，缺少對卵巢結構和功能的動態評價。通過高頻小動物超聲系統持續動態觀察卵巢形態和血流變化，可觀察到卵巢的結構、功能以及衰竭程度。這也對藥物治療的藥效評價增加了一種新的手段，可以進一步通過藥物干預，對卵巢功能的改善進行有效評價。如何使用有效的藥物來干預POI小鼠并動態監測其變化，將是未來研究的方向。

[1] Komorowska B.Autoimmune premature ovarian failure[J].Menopause Rev,2016,15(4): 210-214.

[2] Ayesha,V Jha,Goswami D.Premature Ovarian Failure: An Association with Autoimmune Diseases[J].J Clin Diagnostic Res,2016,10 (10) : QC10

[3] Ebrahimi M,Asbagh F A.The role of autoimmunity in premature ovarian failure[J].Iranian J Reprod Med,2015,13 (8) : 461-472.

[4] Lv X H,Shi D Z.Variations in serum gonadotropin and prolactin levels during consecutive reproductive states in Mongolian gerbils (Meriones unguiculatus) [J].Exp Animals,2011,60 (2) : 169-176.

[5] 吳倩,秦佳佳,李瑞滿.卵巢早衰動物模型研究進展[J].中醫學報,2014,29(9): 1353-1355.

[6] Schnell D,Darmon M.Doppler-based renal resistive index: clinical and prognostic significance[J].Springer Int Publish,2015: 385-396.

[7] 余潔,陳艷屏.彩色多普勒超聲血流分級及阻力指數在乳腺良惡性腫塊鑒別診斷中的應用價值[J].臨床合理用藥雜志,2016,9 (12): 90-91.

[8] Li J K,Zhu Y,Geipel P S.Pulse pressure,arterial compliance and wave reflection under differential vasoactive and mechanical loading[J].Cardiovasc Eng,2010,10(4): 170-175.

[9] Husmann M,Jacomella V,Thalhammer C,et al.Markers of arterial stiffness in peripheral arterial disease[J].Vasa,2015,44(5): 341-348.

[10] 麥日古麗·艾尼外,米熱班·阿不都.卵巢早衰的性激素水平及臨床發病率探討[J].醫學信息,2016,29(34):326

[11] Han Y S,Lee A R,Song H K,et al.Ovarian volume in korean women with polycystic ovary syndrome and its related factors[J].J Menopausal Med,2017,23(1): 25-31.

[12] Silva J B,Panaino T R,Tamm M A,et al.Prediction of metaphase Ⅱ oocytes according to different serum Anti-Müllerian hormone (AMH) levels in antagonist ICSI cycles [J].JBRA Assist Reprod,2016,20(4): 222-226.

Correlativestudiesbetweenhaemodynamicsandsexhormoneconcentrationsinmicewithprimaryovarianinsufficiency

Feng Xunxun1,Dong Xiaoying2*,Zheng Xiurui1

(1.SchoolofBasicMedicalSciences,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China;2.DepartmentofTraditionalChineseMedicine,InstituteofTraditionalChineseMedicine,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

ObjectiveTo study the correlation between haemodynamics and sex hormone concentrations in mice with premature ovarian insufficiency (POI).MethodsBALB/c female mice model of POI was established by multiple sites subcutaneous injection of zona pellucida 3 of mice，and then ovaries were observed by applying ultrasound meanwhile hemodynamics changes were recorded by ultrasound color doppler.Finally,mice serum was taken to be detected.ResultsUnder the images of ultrasound,ovaries of mice in model group experience the volume decrease,follicle decrease and low blood flow.Compared to the blank group,mice of model group have lower pulsatility index (PI),higher resistance index (RI) and an ascending trend of pulse pressure (PP).Moreover,the follicle-stimulating hormone (FSH) and anti-Müllerian hormone (AMH) in mice of model group had a significant difference (P<0.05) compared to the blank group.Then,through the correlation test between haemodynamics and sex hormone concentrations,there was a significant difference in PP and FSH (P<0.05).ConclusionThe PP in haemodynamics and FSH in sex hormone concentrations have a significant difference and it can provide the base for dynamic observation in course of treatment.

POI;ultrasound blood flow;dynamic;sex hormone;correlation

北京市自然科學基金面上項目(7162026)，北京中醫藥薪火傳承“3+3”工程項目(2012-SZ-C-41)，首都中醫藥科技專項(JJ2013-01)，首都醫科大學中醫藥專項課題(15ZY05)。This study was supported by Natural Science Foundation of Beijing(7162026)，Eternal Flame“3+3” Project of Beijing Traditional Chinese Medicine(2012-SZ-C-41)，Capital Traditional Chinese Medicine Project(JJ2013-01)，Capital Medical University Traditional Chinese Medicine Project(15ZY05).

*Corresponding author，E-mail：softsongs@126.com

時間：2017-12-13 21∶26

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20171213.2126.062.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.06.023]

R711.75

2017-06-26)

編輯 慕 萌