食蟹猴腦與結(jié)腸中寡聚化和磷酸化α-突觸核蛋白的增齡性變化的相關(guān)性分析

楊巍巍 李 昕 李旭冉 于 順*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學(xué)研究室 北京市老年病醫(yī)療研究中心，北京 100053；2.首都醫(yī)科大學(xué)帕金森病臨床診療與研究中心，北京 100053；3.帕金森病北京市重點實驗室和教育部神經(jīng)變性病重點實驗室，北京 100053；4.國家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100053)

·Alpha-突觸核蛋白的致病機制·

食蟹猴腦與結(jié)腸中寡聚化和磷酸化α-突觸核蛋白的增齡性變化的相關(guān)性分析

楊巍巍1,2,3,4李 昕1,2,3,4李旭冉1,2于 順1,2,3,4*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學(xué)研究室 北京市老年病醫(yī)療研究中心，北京 100053；2.首都醫(yī)科大學(xué)帕金森病臨床診療與研究中心，北京 100053；3.帕金森病北京市重點實驗室和教育部神經(jīng)變性病重點實驗室，北京 100053；4.國家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100053)

目的研究寡聚化和磷酸化α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-Syn)在食蟹猴結(jié)腸和腦中的增齡性變化及其相關(guān)性。方法ELISA方法檢測寡聚化和磷酸化α-Syn在不同年齡段食蟹猴結(jié)腸與腦中不同部位含量的變化，分析結(jié)腸和腦中寡聚化和磷酸化α-Syn含量變化的相關(guān)性。結(jié)果寡聚化與磷酸化α-Syn含量隨年齡增加而增加，其中老年猴與青年及中年猴比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)腸中的寡聚化和磷酸化α-Syn水平與顳葉、海馬、紋狀體和丘腦中的水平有相關(guān)性。結(jié)論食蟹猴結(jié)腸和腦中寡聚化和磷酸化α-Syn含量隨老化而增加，結(jié)腸和腦中寡聚化和磷酸化α-Syn含量變化呈正相關(guān)。

α-突觸核蛋白；結(jié)腸；腦；食蟹猴；老化

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是臨床上常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一。PD患者的臨床癥狀除了表現(xiàn)為靜止震顫、運動遲緩、肌肉僵直和姿勢不穩(wěn)定等典型運動癥狀之外，早期還出現(xiàn)各種非運動癥狀(non-motor symptoms,NMS)，其中消化道功能紊亂是最常見的早期非運動癥狀之一[1]。目前認(rèn)為，運動癥狀的產(chǎn)生主要是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元大量丟失所致，而消化道功能紊亂被認(rèn)為是由腸神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous system，ENS)的異常引起的。導(dǎo)致黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元丟失和腸神經(jīng)系統(tǒng)功能異常的原因均被認(rèn)為與異常的α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-Syn)聚集所形成路易體(Lewy body，LB)病變有關(guān)[2-3]。根據(jù)Braak理論，LB病變最早可能出現(xiàn)在消化道的壁內(nèi)神經(jīng)叢，然后通過迷走神經(jīng)擴散到延髓，并進一步上行擴散到中腦黑質(zhì)和紋狀體，引起典型的運動癥狀[4-6]。最新研究[7]表明，PD患者糞便樣本中微生物群的變化與臨床表型的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，進一步印證了腸-腦軸在PD病理發(fā)展中的重要性。

雖然聚集的α-Syn纖維被認(rèn)為是LB病變的主要成分，但目前廣泛認(rèn)為寡聚化和磷酸化的α-Syn是該蛋白的主要毒性分子形式[8]。這種分子形式的α-Syn在PD早期發(fā)生何種變化尚不清楚。已知，老化是PD發(fā)病的重要危險因素，老化的神經(jīng)組織也存在LB病變，雖然其數(shù)量較PD患者少。但老化神經(jīng)組織中可溶性的寡聚化和磷酸化的α-Syn發(fā)生何種變化，尤其是其在腦和腸神經(jīng)叢中的變化的規(guī)律及其相關(guān)性尚不清楚。本論文利用老化食蟹猴模型對上述問題進行了探討。

1 材料和方法

1.1 材料

健康食蟹猴青年、中年、老年各4只(4～16歲)，共計12只，購自廣西雄森靈長動物養(yǎng)殖中心，實驗動物許可證號：SYXK(桂)2009-0006，所有動物均有詳細出生檔案和檢疫證書，動物研究方案經(jīng)動物福利委員會(Institutional Animal Care and Use Committee,IACUC)認(rèn)證批準(zhǔn)。青年猴4只(4歲)，中年猴4只(10～11歲)，老年猴4只(15～16歲)。兔抗人磷酸化α-Syn多克隆抗體(Santa Cruz公司，美國)；鼠抗人α-Syn單克隆抗體3D5由本室制備；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG，HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(中杉公司)，生物素化的鼠單克隆抗體(康為世紀(jì)標(biāo)記公司)；4-硝基磷酸二鈉鹽(pNPP)(Sigma公司，美國)；ELISA 96孔酶標(biāo)板(Corning公司，美國)；酶標(biāo)儀(Tecan公司，瑞士)；其他試劑為分析純。

1.2 方法

1)組織勻漿的制備：灌流后取出食蟹猴的一部分結(jié)腸及不同部位腦組織并立即置于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱中保存。為了制備全細胞勻漿，將結(jié)腸和腦組織在裂解液中研磨、裂解，12 000 g離心于4 ℃離心30 min，取上清即為全細胞勻漿，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。

2)寡聚化α-Syn的ELISA檢測[9]：用質(zhì)量濃度為1 × 10-3g/L的3D5單抗包被96孔酶標(biāo)板，100 μL/孔，37 ℃孵育2 h，4 ℃過夜，PBST洗板。10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))BSA封閉，200 μL/孔，37 ℃孵育2 h，PBST洗板。加入倍比稀釋的重組人α-Syn(0.5、0.25、0.125、0.006 25、0.031 25、0 mol/L)和待測樣品，100 μL/孔，37 ℃孵育2 h。PBST洗板，然后加入生物素化的3D5(1 × 10-3g/L)100 μL/孔，37 ℃孵育2 h，PBST洗板，再加入親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶(1∶5 000)，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，PBST洗板，最后加入pNPP，100 μL/孔，37 ℃顯色30 min，405 nm處測定吸光度值。每次每個樣品重復(fù)3孔，重復(fù)3次。

3)磷酸化α-Syn的ELISA檢測：用質(zhì)量濃度為1 × 10-3g/L的磷酸化α-syn多抗包被96孔酶標(biāo)板，100 μL/孔，37 ℃孵育2 h，4 ℃過夜，PBST洗板。10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) BSA封閉，200 μL/孔，37 ℃孵育2 h，PBST洗板。加入倍比稀釋的重組人磷酸化α-Syn(0.5、0.25、0.125、0.006 25、0.031 25、0 mol/L)和待測樣品，100 μL/孔，37 ℃孵育2 h。此后使用試劑盒操作過程與檢測寡聚化α-Syn的ELISA相同。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸中寡聚化和磷酸化α-Syn的增齡性變化

在食蟹猴結(jié)腸中，寡聚化和磷酸化α-Syn水平隨年齡增加而增高，老化組寡聚化和磷酸化α-Syn水平與青年組及中年組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖1。

2.2 不同腦區(qū)中寡聚化和磷酸化α-Syn呈增齡性變化

ELISA結(jié)果顯示，在食蟹猴的顳葉、海馬、紋狀體和丘腦中，寡聚化α-Syn的水平隨年齡增長而增加，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，前額葉和枕葉中的寡聚化α-Syn雖然也有增齡性變化的趨勢，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,圖2A)；磷酸化α-Syn在所有腦區(qū)中均有顯著的增齡性變化，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖2B)。

A：o-α-Syn；B：p-α-Syn.*P<0.01vsyoung monkeys,#P<0.05vsmiddle aged monkeys,n=4.o-α-Syn:α-synuclein oligomers;p-α-Syn: phosphorylated α-synuclein.

圖2 寡聚化和磷酸化α-Syn在食蟹猴不同腦區(qū)中的表達Fig.2 Levels of o-α-Syn and p-α-Syn in different brain regions of aging cynomolgus monkeys

A: levels of o-α-Syn differ between brain regions and increases with age.B: p-α-Syn levels also differ between brain regions and increases with age.The levels of o-α-Syn and p-α-Syn in the extracts isolated from different regions of the brain were measured by ELISA.*P<0.01vsyoung monkeys,#P<0.05vsmiddle age monkeys,n=4.o-α-Syn: α-synuclein oligomers;p-α-Syn: phosphorylated α-synuclein.

2.3 結(jié)腸與腦中寡聚化和磷酸化α-Syn的相關(guān)性分析

結(jié)腸中的寡聚化α-Syn濃度與顳葉、海馬、紋狀體和丘腦中的寡聚化α-Syn濃度呈顯著正相關(guān)，與枕葉中的寡聚化α-Syn濃度有相關(guān)性，但與前額葉中的寡聚化α-Syn濃度沒有相關(guān)性(圖3)。與寡聚化α-Syn相同，結(jié)腸中磷酸化α-Syn濃度也與顳葉、海馬、紋狀體和丘腦中的磷酸化α-Syn濃度呈正相關(guān)，與枕葉中的磷酸化α-Syn濃度有相關(guān)性，但與前額葉中的寡聚化α-Syn濃度沒有相關(guān)性(圖4)。

3 討論

本文利用本室建立的ELISA方法，首次對不同年齡食蟹猴的結(jié)腸和不同腦區(qū)的寡聚化和磷酸化α-Syn的增齡性變化進行了研究。結(jié)果顯示，寡聚化和磷酸化α-Syn濃度在結(jié)腸均隨老化而明顯增高；在腦中，寡聚化和磷酸化α-Syn雖然也表現(xiàn)出隨齡性增加趨勢，但在不同腦區(qū)的變化明顯不同。其中，在丘腦、海馬、紋狀體和顳葉變化比較明顯，而在前額葉和枕葉變化較小。導(dǎo)致寡聚化和磷酸化α-Syn發(fā)生上述增齡性變化的原因很可能是結(jié)腸的壁內(nèi)神經(jīng)和局部腦中的調(diào)節(jié)α-Syn磷酸化的酶在老化過程中發(fā)生變化的結(jié)果。研究[9]表明，α-Syn的磷酸化是該蛋白發(fā)生聚集的主要原因。以往研究[10]證明，腦組織中促進使α-Syn磷酸化和去磷酸化的酶——PLK2和PP2A，呈現(xiàn)年齡及腦區(qū)依賴性的變化，并且是引起磷酸化和寡聚化a-Syn在不同腦區(qū)含量不同和隨齡性變化的主要原因。由此推測，在食蟹猴結(jié)腸的壁內(nèi)神經(jīng)以及本研究所觀察的不同腦區(qū)組織中，也存在PLK2及PP2A活力的隨齡性變化，并因此通過影響α-Syn的磷酸化而影響其寡聚化。在老化過程中是否有其他機制影響α-Syn的磷酸化和寡聚化尚不清楚。

圖3 寡聚化α-Syn濃度在結(jié)腸和不同腦區(qū)中的相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis for levels of o-α-Syn between the colon and different regions of the brain

A：prefrontal lobs;B:occipital lobe;C:temporal lobe;D:hippocampus;E:striatum;F:thalamus;Levels of o-α-Syn in the colon were correlated with those in the occipital lobe (B),temporal lobe(C),hippocampus (D),striatum (E) and thalamus (F) but not in the prefrontal lobe (A);o-α-Syn: α-synuclein oligomers.

圖4 磷酸化α-Syn濃度在結(jié)腸和不同腦區(qū)中的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis for levels of p-α-Syn between the colon and different regions of the brain

A：prefrontal lobs;B:occipital lobe;C:temporal lobe;D:hippocampus;E:striatum;F:thalamus;Levels of p-α-Syn in the colon were correlated with those in the occipital lobe (B),temporal lobe(C),hippocampus (D),striatum (E) and thalamus (F) but not in the prefrontal lobe (A);p-α-Syn:α-synuclein oligomers.

腸神經(jīng)系統(tǒng)是胃腸道神經(jīng)元的綜合網(wǎng)絡(luò)，是腸-腦軸的主要參與者[11]。已有文獻[4-6]報道，在PD發(fā)病早期，腸道首先形成致病性α-Syn寡聚體，通過迷走神經(jīng)首先傳播到腦中。本研究發(fā)現(xiàn)，α-Syn的寡聚化及磷酸化同步發(fā)生在老化的食蟹猴大腦以及結(jié)腸中，提示大腦和胃腸道之間有潛在聯(lián)系。為了證明這種聯(lián)系，本研究對結(jié)腸中寡聚化和磷酸化α-Syn與其在不同腦區(qū)中的水平進行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸中寡聚化和磷酸化α-Syn的變化與一些腦區(qū)如紋狀體，海馬，丘腦和顳葉的變化呈正相關(guān)。相比之下，結(jié)腸α-Syn磷酸化和寡聚化的改變與前額葉中的變化無相關(guān)性。上述相關(guān)性的機制尚不清楚。可能的原因是由于老化過程中的局部代謝環(huán)境變化，例如PLK2和PP2A活性改變，導(dǎo)致腸神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的α-Syn的磷酸化和聚集在老化過程中同步發(fā)生。盡管這些機制尚不明確，但目前的研究[12-14]表明，在老化過程中腸道和腦中磷酸化和寡聚化α-Syn的增加雖然是老化過程中的生理現(xiàn)象，但卻增加了PD發(fā)病風(fēng)險。結(jié)腸與腦中α-Syn磷酸化和寡聚化變化具有相關(guān)性的結(jié)果也為結(jié)腸活檢監(jiān)測PD腦中病理變化提供了理論依據(jù)。

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Correlationbetweenthebrainandage-dependentα-synucleinphosphorylationandoligomerizationinthegutofcynomolgusmonkeys

Yang Weiwei1,2,3,4,Li Xin1,2,3,4,Li Xuran1,2,Yu Shun1,2,3,4*

(1.DepartmentofNeurobiology,XuanwuHospital,CapitalMedicalUniversity,BeijingInstituteofGeriatrics,Beijing100053,China;2.ClinicalCenterforParkinson’sDisease,CapitalMedicalUniversity,Beijing100053,China;3.BeijingKeyLaboratoryforParkinson’sDiseaseandKeyLaboratoryofNeurodegenerativeDiseases,MinistryofEducation,Beijing100053,China;4.NationalClinicalResearchCenterforGeriatricDisorders,Beijing100053,China)

ObjectiveTo explore age-dependent alterations in oligomeric and phosphorylated α-synuclein(o-α-Syn and p-α-Syn) in the colon and brain,analyze the correlation for levels of o-α-Syn and p-α-Syn between the colon and different regions of the brain.MethodsELISA methods specific for o-α-Syn and p-α-Syn were used to measure the levels of o-α-Syn and p-α-Syn in the colon and brain of different ages of cynomolgus monkeys.ResultsLevels of o-α-Syn and p-α-Syn increased significantly with age in the colon and brain,statistically significant difference was observed between the old monkeys and the young and middle-aged monkeys (P<0.01).Levels of o-α-Syn and p-α-Syn in the colon were positively correlated with those in the temporal lobe,hippocampus,striatum and thalamus of the brain.ConclusionLevels of o-α-Syn and p-α-Syn increase with age in the colon and brain and positively correlated between the colon and some vulnerable brain regions.

α-synuclein；colon；brain；cynomolgus monkeys；aging

國家自然科學(xué)基金(81371200,81071014,81401042)，北京市醫(yī)院管理局“使命”計劃專項經(jīng)費資助項目(SML20150803)，北京市科學(xué)技術(shù)委員會資助項目(Z161100005116011，Z171100000117013)，北京市衛(wèi)生和計劃生育委員會項目(PXM2017_026283_000002)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81371200,81071014,81401042),Beijing Municipal Administration of Hospitals’ Mission Plan (SML20150803),Beijing Municipal Science &Technology Commission (Z161100005116011，Z171100000117013),Beijing Municipal Commission of Health and Family Planning (PXM2017_026283_000002).

*Corresponding author，E-mail：yushun103@163.com

時間：2017-12-13 21∶25

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20171213.2125.060.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.06.019]

R 338

2017-10-23)

編輯 慕 萌